Diagnosi biochimica delle malattie del fegato. Brevi informazioni sulla struttura del fegato.

Il fegato è un organo non appesantito del peso di 1300-1800 g Più del 60% delle cellule epatiche sono cellule parenchimali - gli epatociti, il 25% sono cellule del sistema reticoloocistiocitario (CSG), cellule endoteliali o di Kupffer, il resto è duttale, tessuto connettivo e altre cellule.

L'unità strutturale e funzionale del fegato è il fegato acinus o lobulo epatico, che è formato principalmente da epatociti (Figura 1). Nel centro del lobulo epatico si trova la vena epatica, dalla quale si irradiano i raggi del fegato, costituiti principalmente da una singola fila di epatociti. La vena epatica si trova al centro del lobulo, e sulla periferia vi è un campo portale con rami dell'arteria epatica, vena porta e il più piccolo capillare della bile. Tra i fasci ci sono i capillari dilatati - i seni del fegato. Gli epatociti che formano le travi, con un lato, chiamato polo vascolare, affrontano i seni, e le invaginazioni della membrana del lato vicino, chiamato polo biliare (biliare), formano i capillari biliari primari (Figura 2). Una caratteristica della bile canaliculi è il loro completo isolamento dai capillari sanguigni. Attraverso la membrana dell'endocitosi del polo vascolare e l'esocitosi di varie molecole e la biliare - il rilascio di sostanze dalla cellula. La vena porta e l'arteria epatica entrano nel fegato, e la vena epatica e il dotto biliare escono.

Acini è diviso in 3 zone funzionali: in 1 zona ci sono celle adiacenti al tratto portale, sono meglio fornite di ossigeno e sostanze nutritive. Le cellule della terza zona, situate attorno alla vena epatica, sono meno fornite di ossigeno e substrati e più sensibili all'ischemia. Sono le cellule di questa zona che sono coinvolte nel metabolismo dei farmaci e sono l'obiettivo dei farmaci epatotossici.

Quando si eseguono studi di laboratorio per una diagnosi corretta è importante conoscere la distribuzione degli enzimi all'interno della cellula. I seguenti sono dati sugli enzimi più comunemente usati per la diagnosi.

citoplasma contiene alanina aminotransferasi (ALT), parte di aspartato aminotransferasi (AST), lattato deidrogenasi (LDH), parte di gammaglutamyltranspeptidase (GGT) e altri enzimi.

Nei mitocondri (MX) la maggior parte di AST (circa il 70%), il glutammato deidrogenasi (GLDG), l'alcol deidrogenasi e molti altri sono concentrati.

Reticolo endoplasmatico ruvido contiene colinesterasi (CE), ecc.

Nel reticolo endoplasmatico liscio sono glucosio-6-fosfatasi, UDP-glucuroniltransferasi, citocromo P-450 legato alla membrana contenente orlo e altri.

lisosomi contengono idrolasi acide (fosfatasi acida, ribonucleasi, ecc.) che si attivano abbassando il pH cellulare.

Microvilli del polo biliare contengono enzimi dipendenti dalla membrana, come fosfatasi alcalina (fosfatasi alcalina), 5-nucleotidasi, parte di GGT, leucina aminopeptidasi (LAP).

La conoscenza dell'architettura del fegato e la distribuzione degli enzimi all'interno della cellula rendono chiaro l'ineguale aumento dell'attività degli enzimi in vari processi patologici. Così, con la lesione predominante delle parti centrali dei lobuli (epatite alcolica acuta, stasi venosa acuta, ecc.), Aumenta l'attività del glutammato deidrogenasi mitocondriale - mancanza di ossigeno e danno MX, e con la sconfitta dei tratti portale (epatite virale acuta, epatite cronica attiva - CAG), aumenta attività citoplasmatica delle transaminasi.

Diagnosi biochimica delle malattie

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La biochimica clinica, insieme alla fisiologia patologica e normale, è una delle tre balene della scienza medica di base. Senza la conoscenza dei fondamenti di questa disciplina, un medico non è diverso da uno scolaro che ha un'idea delle malattie solo sulla base di sintomi e segni.

Nel frattempo, gli indicatori clinici e biochimici che monitorano i cambiamenti nelle cellule a livello di molecole e reazioni chimiche, consentono di determinare in modo affidabile le cause degli stati patologici del corpo nel suo insieme. Dipende dal livello di formazione del clinico in che modo si approverà con competenza della selezione delle necessarie analisi biochimiche per un esame completo del paziente, e sarà anche in grado di valutare le informazioni diagnostiche, il valore e l'affidabilità.

In medicina, gli studi biochimici di laboratorio sono ampiamente utilizzati per:

- fare una diagnosi accurata,

- individuazione della malattia nella fase preclinica,

- valutare l'efficacia del trattamento prescritto,

- monitoraggio delle condizioni del paziente

- previsione di possibili complicazioni e risultati della malattia.

Test biochimici raccomandati

Sono stati sviluppati metodi di ricerca standardizzati per i principali sistemi del corpo, che devono essere eseguiti senza esito negativo con il complesso sintomatico corrispondente:

Patologia del sistema cardiovascolare.

Angina pectoris (coagulogramma, colesterolo con frazioni, aminotransferasi, trigliceridi, frazioni di lipoproteine, indice aterogenico, lattato deidrogenasi con isoenzimi, creatina chinasi con isoenzimi);

Ipertensione (colesterolo con frazioni, colinesterasi, urea, acido urico, creatinina, trigliceridi, indice aterogenico, livello degli elettroliti K e Na);

Aterosclerosi (colesterolo con frazioni, frazioni di lipoproteine, trigliceridi, indice aterogenico);

Infarto del miocardio (proteine ​​dello stress, creatina chinasi con isoenzimi, aminotransferasi, urea, colinesterasi, coagulogramma, acido urico, lattato deidrogenasi con isoenzimi);

Ipotensione (17 ООС, contenuto di idrocortisone nelle urine).

Patologia del sistema connettivo.

Reumatismi (proteine ​​totali con frazioni proteiche, glicoproteine, test di sedimento, proteine ​​da stress, esosi di glicoproteine, fibrinogeno, acidi sialici);

Artrite reumatoide (proteina comune con frazioni proteiche, glicoproteine, acidi sialici);

Gotta (proteine ​​totali con frazioni proteiche, creatinina, acido urinario, proteine ​​dello stress, glicoproteine);

Scleroderma (proteine ​​totali con frazioni proteiche, fibrinogeno, proteine ​​dello stress, idrossiprolina).

Patologia del sistema biliare e gastrointestinale.

Malattia da calcoli biliari (bilirubina con frazioni, fosfatasi alcalina, Y-glutamil transpeptidasi);

Gastrite atrofica (pepsinogeno, gastrina);

Pancreatite cronica (glucosio, tolleranza al glucosio, proteine ​​totali con frazioni proteiche, amilasi con isoenzimi, lipasi nelle urine e nel sangue);

Necrosi del pancreas (amilasi);

Cambiamenti degenerativi distrofici nel fegato, forma grassa (urea, glutammato deidrogenasi, alanina aminotransferasi, colinesterasi, aspartato aminotransferasi);

Cirrosi epatica (urea, colesterolo, aspartato aminotransferasi, creatinina, alanina aminotransferasi, frazioni proteiche, β lipoproteine, campioni sedimentari);

Epatite cronica (stessa ricerca della cirrosi, oltre a lattato deidrogenasi con isoenzimi, proteine ​​totali, fosfatasi alcalina);

L'epatite è acuta (la stessa ricerca della forma cronica, ad eccezione della fosfatasi alcalina e dell'urea).

Patologia dell'apparato respiratorio.

Ascesso polmonare, bronchite acuta, asma bronchiale (proteine ​​totali con frazioni, stress-proteine);

Bronchiectasie (lo stesso, più fibrinogeno);

Polmonite cronica (proteine ​​totali con frazioni, proteine ​​da stress, lattato deidrogenasi con isoenzimi);

Polmonite acuta (come cronica, più glicoproteine, campioni sedimentari, acidi sialici)

Tubercolosi (proteine ​​totali con frazioni, proteine ​​da stress, acidi sialici, glicoproteine, campioni di sedimenti).

Patologia del sistema urinario.

Insufficienza renale, acuta e cronica (proteine ​​totali con frazioni, creatinina, proteine ​​urinarie, urea, contenuto di elettroliti Na, Cl, K, Ca);

Malattia renale (come in caso di insufficienza, più acido urico ed elettrolita P, ad eccezione di Cl);

Sindrome nefrotica (la stessa di insufficienza, più elettrolita Mg con l'eccezione di Cl);

Amiloidosi dei reni (come nell'insufficienza, più l'elettrolita Mg con l'eccezione di Cl e Y - glutamil transpeptidasi);

Pielonefrite cronica (proteina comune con frazioni, proteine ​​dello stress, fosfatasi alcalina, colinesterasi, proteine ​​delle urine, Y-glutamil transpeptidasi);

Glomerulonefrite (proteine ​​totali con frazioni, proteine ​​da stress, urea, Y-glutamil transpeptidasi, creatinina, lattato deidrogenasi con isoenzimi, colinesterasi).

Patologia del sistema endocrino.

Diabete mellito (glucosio nelle urine e nel sangue, insulina, acetone, colesterolo, beta-lipoproteine, con la probabilità di una forma nascosta - un test per la sensibilità al glucosio);

Diabete non zuccherino (glucosio, vasopressina, test di tolleranza al glucosio);

Ipoparatiroidismo (fosfatasi alcalina, contenuto di elettroliti K e P nel sangue e nelle urine);

Ipotiroidismo (tiroxina, triiodotironina, trigliceridi, beta-lipoproteine, colesterolo, urea);

Tiroidite purulenta (tiroxina, triiodotironina, proteine ​​dello stress, proteine ​​totali con frazioni);

Tiroidite autoimmune (tiroxina, triiodotironina, assorbimento di iodio131 da parte della ghiandola tiroidea, iodio legato alle proteine);

Il gozzo è endemico (lo stesso della forma autoimmune della tiroidite, più il colesterolo e l'urea nelle urine);

Gozzo diffuso, tossico (tiroxina, triiodotironina, TSH, legato a proteine ​​di iodio, glucosio, urea, colesterolo).

Se il medico lo ritiene necessario, oltre ai principali test di laboratorio aggiuntivi vengono nominati. (Guarda il trattamento)

Decodifica dell'analisi biochimica del sangue

Cosa mostra un esame del sangue biochimico?

Il sangue è uno dei biomateriali del corpo. È presente in tutti gli organi e tessuti. La sua composizione include sostanze che si formano durante il lavoro di tutti gli organi. Un esame del sangue per la biochimica determina la presenza e il livello dei suoi componenti.

Confrontando i dati della diagnostica e dei valori normali, è possibile determinare lo stato funzionale degli organi, per determinare la natura delle patologie che si verificano in essi. In alcune malattie, la biochimica del sangue è l'unico modo per confermare obiettivamente la diagnosi.

Oltre ai principali (glucosio, emoglobina, creatinina, colesterolo e altri), l'analisi biochimica rivela anche specifici indicatori (elettroliti, siero, fattore reumatoide e altri) necessari per la diagnosi delle malattie endocrinologiche e genetiche. Il metodo è applicabile anche in pediatria, medicina sportiva per valutare lo stato funzionale del corpo di bambini, atleti.

Quali sono le indicazioni per l'analisi biochimica del sangue?

Spesso, la biochimica viene prescritta a pazienti ospedalizzati o ambulatoriali. Viene eseguito un esame del sangue per diagnosticare o monitorare l'efficacia del trattamento. Il medico individua individualmente l'elenco degli indicatori, il cui livello deve essere impostato nel paziente. Questo può essere un indicatore (ad esempio, glucosio nel diabete mellito) o più (ad esempio, test di funzionalità epatica - proteine ​​totali, bilirubina, indice di protrombina, ALT, AST - nell'epatite).

Le indicazioni per lo studio sono malattie:

  • sistema epatobiliare;
  • i reni;
  • sistema endocrino;
  • cuore;
  • sistema muscolo-scheletrico;
  • sistema circolatorio;
  • tratto gastrointestinale.

In combinazione con i metodi di diagnostica strumentale, la biochimica del sangue aiuta a formulare una diagnosi corretta nella patologia di qualsiasi organo interno.

Come fare un esame del sangue per la biochimica?

L'analisi biochimica esamina il sangue venoso. Prendi il biomateriale dalle vene periferiche (ulnari o radiali). Con accesso limitato all'avambraccio (fratture, ustioni, ecc.), Il sangue viene prelevato da qualsiasi altra vena (mani, piedi, gambe).

Prima di passare l'analisi, il paziente deve preparare:

  • 8 ore prima della donazione di sangue, non si può mangiare, bere bevande contenenti zucchero;
  • per 2 giorni devi astenersi dall'alcol e dai cibi grassi;
  • alla vigilia dello studio evitare lo stress fisico ed emotivo.

L'analisi viene data prima dei farmaci, prima delle procedure diagnostiche e terapeutiche (esame a raggi X, fisioterapia, ecc.).

Il sito di puntura della pelle viene trattato con un antisettico - soluzione alcol etilico al 96% o perossido di idrogeno. Il sangue in un volume di 5-10 ml viene raccolto in un tubo sterile a secco, che viene inviato allo studio.

Norme di analisi biochimica del sangue (tabella)

Norma negli adulti

Nei bambini sotto i 14 anni

Bilirubina totale (tbil)

fino a 250 μmol / l (neonati)

Bilirubina diretta (idil)

Fosfatasi alcalina (alp)

Lipoproteine ​​VP (hdl)

Fino a 6 g / l (durante la gravidanza)

Acido urico (acido urico)

Proteina C-reattiva (crp)

Antistreptolysin O (anche questo)

Come decifrare l'analisi biochimica?

Decifrare l'analisi biochimica del sangue è un confronto tra i risultati ottenuti con le norme degli indicatori. Il modulo di analisi contiene un elenco completo delle sostanze determinate dal laboratorio biochimico e i loro valori di riferimento. A volte è sufficiente stabilire la diagnosi finale sulla base di una deviazione dalla norma di uno o più parametri. Ma più spesso per confermarlo hai bisogno dei risultati di ulteriori ricerche. Successivamente verrà preso in considerazione, il che significa una deviazione dalle norme dei principali indicatori della biochimica del sangue, per le quali le malattie sono tipiche.

Proteine ​​totali

La proteina totale è una raccolta di proteine ​​nel plasma sanguigno. Il suo livello aiuta a identificare le malattie degli organi interni e del sangue. L'indicatore sale in condizioni:

  • disidratazione del corpo (vomito, diarrea, ustioni, ecc.);
  • infezioni acute e croniche;
  • malattie oncologiche.

Il livello di proteine ​​totali diminuisce con:

  • carenza di proteine ​​durante il digiuno;
  • malattia del fegato;
  • sanguinamento acuto e cronico;
  • tireotossicosi.

bilirubina

La bilirubina è un pigmento biliare formatosi a causa della distruzione dei globuli rossi. Il metabolismo si verifica a causa del normale funzionamento del fegato. Il suo livello varia con le malattie del fegato, le vie biliari, l'anemia. La bilirubina è una frazione libera e legata. L'aumento del primo indicatore si verifica quando:

  • epatite virale acuta, tossica, di droga;
  • danno batterico del fegato (leptospirosi, brucellosi, ecc.);
  • tumori del fegato, cirrosi biliare primitiva;
  • anemia emolitica.

L'aumento del contenuto di bilirubina legata è tipico delle malattie che interrompono il flusso della bile:

  • malattia da calcoli biliari;
  • tumore pancreatico;
  • malattie infiammatorie delle vie biliari, ecc.

enzimi

L'attività enzimatica caratterizza lo stato degli organi interni. Aumento delle prestazioni con la sconfitta delle cellule organiche. L'aumento del livello di aminotransferasi ALAT, ALAT si verifica quando:

  • epatite acuta, cronica;
  • necrosi epatica;
  • infarto miocardico;
  • lesioni e malattie del muscolo scheletrico;
  • colestasi;
  • grave ipossia tessutale.

Elevati livelli di lattato deidrogenasi (LDH) sono tipici per:

  • infarto miocardico, rene;
  • miocardite;
  • emolisi estesa;
  • embolia polmonare;
  • epatite acuta.

Livelli elevati di creatina fosfochinasi (CPK) possono verificarsi quando:

  • infarto miocardico;
  • necrosi dei muscoli scheletrici;
  • epilessia;
  • miosite e distrofia muscolare.

L'urea appartiene al gruppo di substrati: un composto a basso peso molecolare sintetizzato dal fegato. Il livello della sostanza nel sangue dipende dalla capacità di filtrazione dei reni e dalla funzione sintetica del fegato. Motivi per l'aumento:

  • malattie renali (glomerulonefrite, amiloidosi, pielonefrite, trattamento con farmaci nefrotossici);
  • insufficienza cardiovascolare;
  • massiccia perdita di sangue;
  • ustioni;
  • violazione del deflusso delle urine;
  • mangiare proteine ​​in eccesso.

Motivi per ridurre il livello di urea:

  • il digiuno e il rigoroso vegetarianismo;
  • avvelenamento con veleni;
  • la gravidanza;
  • violazione della funzione sintetica del fegato.

Acido urico

L'acido urico è il prodotto finale del metabolismo di alcune proteine. La sua parte principale è escreta dai reni, il resto - con le feci. Un aumento del livello di acido urico nel sangue indica le seguenti condizioni:

  • insufficienza renale;
  • la leucemia;
  • linfoma;
  • digiuno prolungato;
  • abuso di alcol;
  • sovradosaggio con salicilati e diuretici.

Quanto costa un esame del sangue biochimico?

Il costo degli esami del sangue biochimici dipende dal numero di parametri determinati. Il prezzo di ciascuno di essi varia da 130-300 rubli. Il metodo più costoso di analisi del sangue biochimiche è immunoelettroforesi, il cui costo in alcune cliniche raggiunge i 1000 rubli.

Biochimica e patobiochimica del fegato. Diagnosi biochimica delle malattie del fegato

Diagnosi biochimica delle malattie del fegato.

DIAGNOSTICA BIOCHIMICA DELLE MALATTIE DEL FEGATO.

Brevi informazioni sulla struttura del fegato.

Il fegato è un organo non appesantito del peso di 1300-1800 g Più del 60% delle cellule epatiche sono cellule parenchimali - gli epatociti, il 25% sono cellule del sistema reticoloocistiocitario (CSG), cellule endoteliali o di Kupffer, il resto è duttale, tessuto connettivo e altre cellule.

L'unità strutturale e funzionale del fegato è il fegato acinus o lobulo epatico, che è formato principalmente da epatociti (Figura 1). Nel centro del lobulo epatico si trova la vena epatica, dalla quale si irradiano i raggi del fegato, costituiti principalmente da una singola fila di epatociti. La vena epatica si trova al centro del lobulo, e sulla periferia vi è un campo portale con rami dell'arteria epatica, vena porta e il più piccolo capillare della bile. Tra i fasci ci sono i capillari dilatati - i seni del fegato. Gli epatociti che formano le travi, con un lato, chiamato polo vascolare, affrontano i seni, e le invaginazioni della membrana del lato vicino, chiamato polo biliare (biliare), formano i capillari biliari primari (Figura 2). Una caratteristica della bile canaliculi è il loro completo isolamento dai capillari sanguigni. Attraverso la membrana dell'endocitosi del polo vascolare e l'esocitosi di varie molecole e la biliare - il rilascio di sostanze dalla cellula. La vena porta e l'arteria epatica entrano nel fegato, e la vena epatica e il dotto biliare escono.

Acini è diviso in 3 zone funzionali: in 1 zona ci sono celle adiacenti al tratto portale, sono meglio fornite di ossigeno e sostanze nutritive. Le cellule della terza zona, situate attorno alla vena epatica, sono meno fornite di ossigeno e substrati e più sensibili all'ischemia. Sono le cellule di questa zona che sono coinvolte nel metabolismo dei farmaci e sono l'obiettivo dei farmaci epatotossici.

Quando si eseguono studi di laboratorio per una diagnosi corretta è importante conoscere la distribuzione degli enzimi all'interno della cellula. I seguenti sono dati sugli enzimi più comunemente usati per la diagnosi.

citoplasma contiene alanina aminotransferasi (ALT), parte di aspartato aminotransferasi (AST), lattato deidrogenasi (LDH), parte di gammaglutamyltranspeptidase (GGT) e altri enzimi.

Nei mitocondri (MX) la maggior parte di AST (circa il 70%), il glutammato deidrogenasi (GLDG), l'alcol deidrogenasi e molti altri sono concentrati.

Reticolo endoplasmatico ruvido contiene colinesterasi (CE), ecc.

Nel reticolo endoplasmatico liscio sono glucosio-6-fosfatasi, UDP-glucuroniltransferasi, citocromo P-450 legato alla membrana contenente orlo e altri.

lisosomi contengono idrolasi acide (fosfatasi acida, ribonucleasi, ecc.) che si attivano abbassando il pH cellulare.

Microvilli del polo biliare contengono enzimi dipendenti dalla membrana, come fosfatasi alcalina (fosfatasi alcalina), 5-nucleotidasi, parte di GGT, leucina aminopeptidasi (LAP).

La conoscenza dell'architettura del fegato e la distribuzione degli enzimi all'interno della cellula rendono chiaro l'ineguale aumento dell'attività degli enzimi in vari processi patologici. Così, con la lesione predominante delle parti centrali dei lobuli (epatite alcolica acuta, stasi venosa acuta, ecc.), Aumenta l'attività del glutammato deidrogenasi mitocondriale - mancanza di ossigeno e danno MX, e con la sconfitta dei tratti portale (epatite virale acuta, epatite cronica attiva - CAG), aumenta attività citoplasmatica delle transaminasi.
Le principali funzioni del fegato.

Il fegato è chiamato il laboratorio metabolico centrale, perché converte in modo altrettanto efficace sostanze provenienti dall'intestino e prodotti metabolici formati in vari organi e tessuti come risultato della loro attività vitale. Attualmente sono note più di 500 funzioni metaboliche. Considera brevemente i principali.

1. Sintetico. Il fegato sintetizza proteine, enzimi, fattori di coagulazione, colesterolo, fosfolipidi, ecc. La principale formazione di corpi chetonici avviene nel fegato.

2. Disintossicante per endogeno (ammoniaca, bilirubina, ecc.). e esogeno (droghe, ecc.) sostanze. La disintossicazione dei farmaci comprende 2 fasi: 1 - modifica dei farmaci nelle reazioni di ossido-riduzione utilizzando citocromo P 450 e coniugazione di farmaci con sostanze idrosolubili mediante aggiunta di glucuronico, acido solforico, glutatione, ecc. In caso di malattie del fegato, le reazioni di prima fase sono ridotte o assenti.

3. Secretory - secrezione della bile. L'apparato di secrezione biliare comprende i bile canaliculi, i microvilli, i lisosomi adiacenti ad essi e il complesso di Golgi. Il meccanismo della secrezione biliare include il rilascio di colesterolo, acidi biliari, pigmenti, fosfolipidi sotto forma di uno specifico complesso macromolecolare - la micella biliare. Gli acidi biliari primari formati nel fegato entrano nell'intestino, dove vengono convertiti in acidi biliari secondari dall'azione della flora intestinale. Questi ultimi vengono assorbiti nell'intestino e rientrano nel fegato (circolazione enteroepatica). Il fegato li coniuga con glicina e taurina, trasformandoli in composti anfifilici con un'alta capacità di emulsionare quelli idrofobici. sostanze. Qualsiasi processo che causa una violazione del rapporto dei componenti nella bile (ormonale, infiammatorio, ecc.), Porta a una violazione della secrezione biliare - colestasi.

4. Excretory - escrezione con la bile di varie sostanze, compresi i solidi.

Il fegato prende parte a tutti i tipi di metabolismo.

1. Scambio di proteine. Il fegato sintetizza le seguenti proteine:

albumina 100%, fibrinogeno

1-globuline 90%, fattori di coagulazione del sangue

2-globuline 75% (compresa la vitamina K-dipendente)

-globuline 50%, pseudocolinesterasi (CE)

L'albumina appartiene alle proteine ​​del sangue più leggere, OMM 65-70 kD, ed è sintetizzata esclusivamente dal fegato. Le albumine mantengono una pressione oncotica, una goccia nel loro contenuto porta ad edema. Se una diminuzione della concentrazione di albumina non è associata alla malnutrizione, una violazione dell'assorbimento intestinale o una grande perdita di proteine, è dovuta ad una marcata diminuzione della funzionalità epatica. Le albumine svolgono un ruolo importante nel trasporto di sostanze scarsamente solubili in acqua (idrofobiche). Tali sostanze includono la bilirubina, il colesterolo, gli acidi grassi, un certo numero di ormoni e farmaci. La violazione della funzione di trasporto dell'albumina porta a molti cambiamenti patologici.

Il fegato mantiene il livello di amminoacidi, incl. ciclico (tirosina, triptofano, fenilalanina,), neutralizza l'ammoniaca, trasformandola in urea. La sintesi di urea è una delle funzioni più stabili del fegato.

2. Scambio lipidico. La sintesi del colesterolo è del 90% effettuata dal fegato e dall'intestino. Una parte significativa del colesterolo nel fegato viene convertita in acidi biliari, ormoni steroidei, vitamina D2. Il fegato converte gli acidi grassi a catena corta che sono tossici per il cervello (4-8 atomi di carbonio - acido caproico, isovalerico, ecc.) In acidi grassi a catena lunga (16-18 atomi di carbonio).

3. Scambio di carboidrati. Il fegato mantiene un livello stabile di glicemia mediante glicogenesi, glicogenolisi, gluconeogenesi. Il fegato produce insulinasi - enzimi che abbattono l'insulina, supportano il livello di acido lattico e piruvico.

4. Il metabolismo del pigmento comporta la conversione dell'epatocita mediante coniugazione con acido glucuronico di una bilirubina tossica, liposolubile indiretta, verso un diretto non tossico, solubile in acqua. Il rilascio di glucuronide bilirubante può avvenire sia per secrezione diretta nel capillare della bile, sia per incorporazione nella micella biliare.

5. Il metabolismo della porfirina comporta la sintesi di un eme costituito da un complesso di protoporfirina con ferro. L'eme è necessario per la sintesi degli enzimi epatici contenenti eme (citocromi, ecc.). Anormalità congenita della sintesi dell'eme nel fegato porta a malattie - porfiria epatica.

6. Scambio di ormoni. Nelle malattie del fegato si osserva un aumento del livello degli ormoni associato a una violazione della loro secrezione con la bile o una distorsione del normale metabolismo ormonale (distruzione insufficiente). Aumentano il livello di adrenalina e noradrenalina (i mediatori del sistema nervoso simpatico), l'aldosterone mineralocorticoide, gli ormoni sessuali, in particolare gli estrogeni, la serotonina e l'istamina.

7. Scambio di elementi in traccia. Il fegato sintetizza le proteine ​​per il trasporto (transferrina) e la deposizione (ferritina) del ferro, è anche il principale deposito di ferro. Il fegato svolge un ruolo importante nel metabolismo del rame: sintetizza ceruloplasmina, una glicoproteina che lega fino al 90% di rame nel sangue, e assorbe anche il rame che è legalmente legato all'albumina dal plasma sanguigno e secerne il rame in eccesso attraverso i lisosomi con la bile nell'intestino. Il fegato partecipa allo scambio di altri oligoelementi ed elettroliti.

Le principali sindromi nelle malattie del fegato.
In varie malattie del fegato, alcuni tipi di metabolismo o determinate funzioni dell'organo sono disturbati. Alcune malattie sono accompagnate da un danno predominante alle cellule del fegato. altri - una violazione primaria del deflusso della bile, ecc, quindi la diagnosi di malattie del fegato è spesso effettuata sindromica. Quanto segue descrive le sindromi principali (Tabella 7).

1. La sindrome citolitica (citolisi) si verifica in seguito all'interruzione della struttura delle cellule epatiche, un aumento della permeabilità della membrana, di regola, a causa dell'aumento dei processi di perossidazione lipidica (LPO) e del rilascio di enzimi nel sangue. Nella sindrome citolitica, entrambi i componenti citoplasmatici e mitocondriali degli enzimi entrano nel flusso sanguigno, ma gli isoenzimi citoplasmatici determinano il livello principale di attività. La citolisi accompagna principalmente le malattie acute del fegato e aumenta con l'esacerbazione di quelle croniche. Si distinguono i seguenti principali meccanismi di citolisi:

1) citolisi tossica (virale, alcolica, farmaco);

2) citolisi immune, incl. autoimmune;

4) ipossico ("fegato d'urto", ecc.);

5) citolisi tumorale;

6) citolisi associata a carenze nutrizionali e inadeguatezza del cibo.

La citolisi non è identica alla necrosi cellulare: durante la citolisi, la cellula rimane viva e capace di vari tipi di metabolismo, compresa la sintesi di enzimi, quindi, durante la citolisi, l'attività degli enzimi può aumentare decine o centinaia di volte e rimanere elevata per un lungo periodo. La necrosi implica la morte cellulare, quindi l'aumento dell'attività enzimatica può essere significativo, ma di breve durata.

I principali marcatori disponibili della citolisi nell'epatite acuta sono le transaminasi alanina (ALT) e aspartico (AST), la gamma-glutamil transpeptidasi (GGT), la lattato deidrogenasi (LDH).

Aumento di ALT e AST osservato nell'88-97% dei pazienti a seconda del tipo di epatite, più della metà di essi, vi è un aumento significativo (10-100 volte). L'attività massima è caratteristica per la 2-3a settimana della malattia, e il ritorno alla normalità è a 5-6 settimane. Il superamento della normalizzazione dell'attività è un fattore sfavorevole. Attività ALT> AST, che è associato alla distribuzione di AST tra citoplasma e mitocondri. L'aumento predominante di AST è associato al danno mitocondriale ed è osservato con danni al fegato più gravi, specialmente l'alcol. L'attività delle transaminasi aumenta moderatamente (2-5 volte) nelle malattie croniche del fegato, solitamente nella fase acuta, e nei tumori del fegato. Per la cirrosi epatica, un aumento dell'attività delle tranaminasi, di regola, non è caratteristico.

Gamma-glutamil transpeptidasi (GGT, GGTP, -GT) è contenuto nel citoplasma (isoforma a basso peso molecolare) ed è associato alle membrane del polo biliare (isoforma ad alto peso molecolare). Un aumento della sua attività può essere associato a citolisi, colestasi, intossicazione da alcool o droga, crescita del tumore, quindi un aumento dell'attività GGT non è specifico per una particolare malattia, ma in una certa misura universale o screening per malattie del fegato, sebbene comporti ulteriori ricerche per la causa della malattia.

Lattato deidrogenasi (LDH) aumenta con molte malattie. Il valore diagnostico dell'attività totale è piccolo ed è limitato alla definizione per escludere i processi tumorale ed emolitico, così come per la diagnosi differenziale della sindrome di Gilbert (normale) e dell'emolisi cronica (aumentata). Per la diagnosi della patologia epatica, valutazione più significativa dell'isoenzima epatico LDH - LDH5.

Un aumento dell'attività di uno o tutti gli enzimi indica una malattia epatica acuta, un'esacerbazione di una malattia cronica o un processo tumorale, ma non indica la natura della malattia e non consente una diagnosi.
2. La sindrome colestatica (colestasi) è caratterizzata da una violazione della secrezione biliare. Alcuni autori identificano una rara forma anterteriosa di colestasi associata a cambiamenti nei rapporti normali dei componenti della bile (cambiamenti ormonali, disturbi della circolazione enteroepatica del colesterolo). La colestasi intraepatica associata alla compromissione della secrezione biliare da parte degli epatociti o alla formazione di bile nei dotti biliari e nella colestasi extraepatica dovuta all'ostruzione dei dotti biliari con la pietra, il tumore o la somministrazione di farmaci che causano colestasi si distinguono. Con la colestasi, le sostanze che vengono escrete nella bile in persone sane entrano e si accumulano nel plasma sanguigno, e l'attività dei cosiddetti indicatori enzimi della colestasi aumenta. La tipica forma itterica della colestasi è caratterizzata da prurito e ittero.

La colestasi aumenta il contenuto di acidi biliari; bilirubina con un aumento predominante della coniugazione, parte della bile (cholebilirubina); colesterolo e -lipoproteine; attività enzimatica fosfatasi alcalina, GGT, 5-nucleotidasi.

Fosfatasi alcalina (fosfatasi alcalina) mostra la sua attività a pH 9-10, è contenuta nel fegato, nell'intestino, nel tessuto osseo, ma l'organo escretore principale è il fegato. Nell'epatocita, la fosfatasi alcalina è associata alle membrane del polo biliare e ai microvilli epiteliali dei dotti biliari. Le cause dell'iperfermentemia sono l'eliminazione ritardata dell'enzima nella bile e l'induzione della sintesi enzimatica, a seconda del blocco della circolazione enteroepatica. L'aumento dell'attività nelle malattie del fegato indica più spesso colestasi, in cui l'attività enzimatica aumenta di 4-10 giorni fino a 3 o più volte, così come i tumori del fegato. Con l'aumento dell'attività della fosfatasi alcalina dovrebbe essere una diagnosi differenziale con malattie ossee.

5-nucleotidase appartiene al gruppo di fosfatasi alcaline, varia in parallelo con loro, ma l'aumento della sua attività è associato esclusivamente alla colestasi. Tuttavia, la mancanza di kit commerciali disponibili non consente di utilizzare questo indicatore per intero.

GGT È anche un enzima legato alla membrana e con la colestasi sale a causa dell'attivazione della sintesi. Lo studio del GGT con colestasi è considerato obbligatorio.

La distruzione dell'escrezione biliare porta ad una compromissione dell'emulsione dei grassi e una diminuzione dell'assorbimento delle sostanze liposolubili nell'intestino, compresa la vitamina K. Ridurre la quantità di vitamina K nel corpo porta ad una diminuzione della sintesi dei fattori di coagulazione del sangue dipendenti dalla vitamina K e una diminuzione dell'indice di protrombina (PTI). Con la somministrazione intramuscolare di vitamina K con PI di colestasi in un giorno aumenta del 30%.

3. La sindrome epatodepressiva comprende qualsiasi disfunzione del fegato, non accompagnata da encefalopatia. La sindrome si presenta in molte malattie del fegato, ma è più pronunciata nei processi cronici. Per indicare la sindrome, vengono utilizzati test di stress e determinazione della concentrazione o dell'attività di vari componenti di siero o plasma.

I test di stress sono sensibili, ma raramente utilizzati. Questi includono:

a) test sulla funzione escretoria del fegato - bromsulfalein, indocyanova, ecc.;

b) test per la funzione detossificante del fegato - antipirina, caffeina, campione rapido.

Gli studi hanno dimostrato che la funzione sintetica è la meno stabile per le malattie del fegato e la sintesi di quelle sostanze, che si formano principalmente nel fegato, diminuisce prima di tutto. I seguenti sono indicatori disponibili e informativi di epatodecretion:

1. Albumina quasi completamente sintetizzato dal fegato. Una diminuzione della sua concentrazione si osserva nella metà dei pazienti con acuta e nell'80-90% dei pazienti con CAH e cirrosi epatica. L'ipoalbuminemia si sviluppa gradualmente, il risultato può essere una diminuzione della pressione sanguigna oncotica ed edema, nonché una diminuzione del legame di composti idrofobi e anfifilici di natura endogena ed esogena (bilirubina, acidi grassi liberi, droghe, ecc.), Che possono causare fenomeni di intossicazione. Determinazione parallela informativa di albumina e proteine ​​totali. Di norma, il contenuto proteico totale rimane normale o aumenta a causa delle immunoglobuline (Ig) sullo sfondo di una diminuzione della concentrazione di albumina. La riduzione dell'albumina a 30 g / lo meno indica un processo cronico.

2. -1-Antitripsina - glicoproteina che costituisce l'80-90% della frazione 1-globulina, una proteina di fase acuta, sintetizzata nel fegato, è un indicatore sensibile dell'infiammazione delle cellule parenchimali. Eccezionale significato diagnostico associato al deficit proteico congenito, che porta a gravi forme di danni al fegato e ad altri organi nei bambini.

3. colinesterasi (pseudo-colinesterasi, butirrilcolinesterasi - HE, BChE) siero, sintetizzato dal fegato, si riferisce a2-globuline. Una delle loro funzioni è la scissione dei rilassanti muscolari derivati ​​dalla succinil dicolina (listenon, ditilina). La mancanza di un enzima o la comparsa di forme atipiche complica la disgregazione dei farmaci, che complica il processo di recupero dall'anestesia. Per prevenire le complicanze postoperatorie, si consiglia di determinare l'attività dell'enzima e il numero di dibukain, vale a dire il grado di inibizione dell'enzima dibucaina. Nei processi cronici, in particolare nella cirrosi epatica, l'attività enzimatica diminuisce e il grado di riduzione ha un valore prognostico. Un altro motivo per la diminuzione dell'attività è l'avvelenamento da organofosfati.

4. Fibrinogeno, Il fattore di coagulazione, proteina di fase acuta, si riferisce a 2-globuline. Il livello di fibrinogeno diminuisce naturalmente con gravi malattie epatiche croniche e acute.

5. PTI diminuisce a causa della compromissione della sintesi dei fattori di coagulazione dipendenti dalla vitamina K (II, VII, IX, X). A differenza della colestasi, il livello di IPT non è normalizzato con la somministrazione intramuscolare di vitamina K. L'IPT è un marker della gravità della disfunzione epatica acuta.

6. colesterolo diminuzione del sangue nei pazienti con epatite cronica e cirrosi epatica, più spesso con una variante subacuta del corso. Nel fegato grasso, i livelli di colesterolo possono aumentare.

Per le malattie epatiche croniche nella fase di compensazione, l'aumento dell'attività enzimatica è insolitamente. Tuttavia, un moderato aumento (di un fattore di 1,5-3) nell'attività delle transaminasi con un livello più elevato di AST indica danni alle strutture subcellulari, in particolare, MX.

4. La sindrome mesenchimale-infiammatoria è causata dal danno al mesenchima e allo stroma del fegato, è essenzialmente una risposta immunitaria alla stimolazione antigenica di origine intestinale. Questa sindrome accompagna malattie epatiche sia acute che croniche. I marcatori della sindrome sono -globuline, immunoglobuline, timolo, anticorpi contro elementi cellulari, ecc.

definizione -globuline si riferisce alle prove obbligatorie per il fegato. L'aumento delle -globuline, che sono essenzialmente immunoglobuline, è caratteristico della maggior parte delle malattie del fegato, ma è più pronunciato nel CAG e nella cirrosi epatica. Recentemente è stato dimostrato che le β-globuline possono essere prodotte dalle cellule di Kupffer e dalle plasmacellule di infiltrati epatici infiammatori. Con la cirrosi del fegato sullo sfondo della bassa concentrazione di albumina, a causa di una violazione della funzione sintetica del fegato, si osserva un aumento significativo delle α-globuline, mentre la concentrazione delle proteine ​​totali può rimanere normale o elevata.

Immunoglobuline (Ig) sono proteine ​​incluse nella frazione -globulina e in possesso delle proprietà degli anticorpi. Esistono 5 classi principali di Ig: IgA, IgM, IgG, IgD, IgE, ma i primi tre sono utilizzati per la diagnosi. Nelle malattie croniche del fegato, il contenuto di tutte le classi di Ig aumenta, ma la crescita di IgM è più pronunciata. Con danno epatico alcolico si osserva un aumento di IgA.

Test di timolo - metodo di ricerca non specifico, ma accessibile, il cui risultato dipende dal contenuto di IgM, IgG e lipoproteine ​​nel siero. Il test è positivo nel 70-80% dei pazienti con epatite virale acuta nei primi 5 giorni del periodo itterico, nel 70-80% dei pazienti con CAH e nel 60% con cirrosi epatica. Il campione è normale in ittero ostruttivo nel 95% dei pazienti.

Anticorpi anti-tessuto e antigeni cellulari (nucleare, muscolo liscio, mitocondriale) permettono di identificare i componenti autoimmuni nelle malattie del fegato.

Ulteriori metodi di ricerca includono la definizione di aptoglobina, orozomukoida, 2-macroglobulina, 2-microglobulina, idrossiprolina, acidi uronici.
Tabella 1.

Diagnosi biochimica delle malattie

Biochimici Diagnostica diagnostica biochimica (chimica clinica (biochimica), patohimiya) - direzione diagnosi di laboratorio clinico, il cui scopo è quello di monitorare la condizione del paziente e la diagnosi delle malattie mediante determinazione dei componenti chimici nel materiale biologico (sangue, urina, talvolta nelle feci, fluido pleurico o cerebrospinale).

plasma sanguigno - fluido corporeo, che ha una composizione chimica complessa comprendente una grande quantità di ioni inorganici, enzimi, ormoni, proteine, lipidi e carboidrati, così come i gas disciolti - ossigeno e anidride carbonica. La concentrazione di tutti i componenti del sangue in una persona sana è entro certi limiti, il che riflette il normale stato funzionale sia dell'organismo nel suo insieme che di ciascuna delle sue cellule separatamente. Nel caso di varie malattie, vi è una violazione delle funzioni di organi e sistemi, che porta a uno squilibrio e concentrazione di uno o più componenti del sangue. L'analisi chimica del sangue nel processo di diagnosi si basa su questo principio. L'elenco delle condizioni patologiche in cui è necessaria l'analisi biochimica del sangue e delle urine è piuttosto ampio e comprende malattie dell'apparato cardiovascolare, endocrino, respiratorio, escretore e di altro tipo. Le malattie derivanti dalla malnutrizione vengono diagnosticate anche mediante analisi del sangue biochimiche. Le carenze alimentari possono essere rilevate utilizzando metodi diagnostici di laboratorio.

Le sostanze specifiche possono anche essere rilasciate nel flusso sanguigno da alcuni tipi di cellule tumorali. Il ruolo dei laboratori biochimici nel monitoraggio e nella diagnosi del cancro è limitato alla misurazione dei livelli ematici di questi "marcatori tumorali".

La sicurezza e l'efficacia della terapia farmacologica dipendono dalla misurazione della concentrazione di sostanze stupefacenti nel sangue. E questo è solo un aspetto dell'enorme ruolo della diagnostica biochimica nel monitoraggio della terapia del paziente.

Oggi la maggior parte dei test su sangue e urine viene eseguita utilizzando moderni sistemi diagnostici ad alta tecnologia, gli analizzatori biochimici dei quali consentono di eseguire fino a 1000 test in 1 ora, fino a 20 o più su ciascun campione. E il risultato della diagnosi della maggior parte dei test arriva entro 12-24 ore. La maggior parte dei laboratori esegue un elenco specifico di test 24 ore su 24, poiché con la diagnostica urgente i risultati del test devono essere pronti entro 1 ora.

Il TAT (o la velocità della diagnostica di laboratorio) è il tempo dal momento in cui il test viene assegnato al momento in cui viene ricevuto il risultato del test o dal momento in cui il materiale viene prelevato al momento in cui viene ricevuto il risultato del test. Il TAT dovrebbe corrispondere alla velocità di sviluppo del processo patologico, nonché alle possibilità di correzione farmacologica o di altro tipo.

Alcuni pazienti dei reparti, unità di terapia intensiva e unità di terapia intensiva spesso necessitano di un monitoraggio costante di determinati parametri del sangue. In queste condizioni, l'infermiere di questo dipartimento può eseguire un elenco limitato di test utilizzando l'attrezzatura necessaria che si trova nel dipartimento.

CAPITOLO 4 DIAGNOSTICA BIOCHIMICA DEI PROCESSI PATOLOGICI E MALATTIE EREDITARIE

4.1. PATOLOGIA CARDIOVASCOLARE

Nel campo della patologia cardiovascolare, la biochimica clinica ha ottenuto il maggior successo nella diagnosi di infarto del miocardio. Metodi di enzimologia clinica e immunoistochimica consentono la diagnosi di infarto miocardico nelle prime ore della sua comparsa, identificare la condizione clinica di angina instabile, diagnosi differenziale di angina grave (ischemia) e la perdita di miociti (anossia), per valutare l'efficacia della trombolisi e fenomeno riperfusione.

In accordo con le raccomandazioni dell'OMS, la diagnosi di infarto del miocardio si basa su un tipico quadro clinico di un attacco di dolore al petto; Modifiche all'ECG; aumento dell'attività del sangue degli enzimi cardiospecifici (marcatori).

Allo stesso tempo, recidiva di infarto miocardico, infarto, e la fibrillazione atriale, così come la presenza del conducente del ritmo del paziente (pacemaker) per la diagnosi di infarto miocardico su dati ECG è molto più difficile. Inoltre, oltre il 25% dei pazienti nei quali l'infarto miocardico è stato confermato all'autopsia non ha avuto cambiamenti ECG. Secondo uno studio prospettico condotto negli Stati Uniti, una diagnosi di infarto del miocardio senza uno studio dei marcatori cardiospecifici della morte dei miociti può essere effettuata solo nel 25% dei casi.

Tra i pazienti consegnati al reparto di terapia intensiva con dolore al cuore, solo il 10-15% ha un infarto miocardico. La necessità di diagnosticare l'infarto del miocardio nelle fasi iniziali è dettata dal fatto che la terapia trombolitica nelle prime 2-6 ore riduce la mortalità precoce in media del 30% e la terapia iniziata in 7-12 ore - solo del 13%. La terapia trombolitica dopo 13-24 ore non riduce il tasso di mortalità.

La diagnosi precoce dell'infarto miocardico consente di applicare e l'angioplastica transluminale e l'efficacia del trattamento conservativo è più elevata, se inizia il prima possibile.

È anche necessario condurre una diagnosi differenziale di infarto del miocardio con angina instabile, quando il trattamento precoce può prevenire l'infarto del miocardio.

Negli ultimi anni, l'arsenale dei marcatori biochimici della morte dei miociti è stato integrato con nuovi test altamente specifici che consentono di diagnosticare l'infarto del miocardio nelle prime ore del suo verificarsi. Si tratta di test che possono essere applicati nella prima fase dell'assistenza medica, nonché la determinazione di isoenzimi cardiospecifici e marcatori proteici per la morte dei miociti utilizzati nell'unità di terapia intensiva delle istituzioni mediche. Allo stesso tempo, il successo della tecnologia industriale e il rilascio di sistemi diagnostici basati sul principio della "chimica secca", consentono di determinare specifici marcatori di morte dei miociti nella prima fase dell'assistenza medica. Tuttavia, anche in queste condizioni, gli errori diagnostici sono possibili se la fisiopatologia dell'infarto del miocardio e i meccanismi di ammissione al sangue di marcatori proteici specifici e non specifici della morte dei miociti non sono chiaramente compresi.

La localizzazione nella cellula ha un impatto significativo sulla velocità di rilascio del marcatore dal miocita danneggiato. Gli enzimi del citosol sono rilasciati più velocemente di quelli strutturati sulle membrane intracellulari. In contrasto con i marcatori citosolici, è richiesto il rilascio dell'apparato contrattile intracellulare per raggiungere lo spazio interstiziale delle proteine ​​correlate alla struttura, che rallenta il processo di comparsa dei marcatori nel sangue; questi ultimi vengono rilasciati enzimi mitocondriali.

Nello studio dei marcatori cardiaci di infarto miocardico, è necessario prendere in considerazione una serie di disposizioni, indicate come i principi della diagnosi di infarto del miocardio. Questi includono: 1) intervalli di tempo; 2) lo studio dei markers del danno miocardico nelle dinamiche; 3) specificità d'organo di diagnosi di laboratorio di infarto del miocardio; 4) la natura complessa della diagnosi; 5) il concetto di "zona grigia".

Marcatori praticamente significativi della morte dei miociti sono la concentrazione catalitica nel sangue di KK, LDH, AST, glicogeno fosforilasi (GF), un aumento del contenuto ematico di mioglobina, catene di miosina, troponine Ti I. Per il solo danno di cardiomiociti (ma non miociti muscolo scheletrici) è specifico concentrazioni ematiche di isoenzimi KK-MB e LDH1, determinazione immunochimica di CK-MB e GF-BB, nonché del rapporto delle isoforme dell'isoenzima CK-MB e delle troponine.

Nella diagnosi di infarto del miocardio, è importante considerare il tempo trascorso dall'esordio dell'angina. Ciò è dovuto al fatto che un periodo piuttosto lungo passa dal momento della morte dei miociti alla comparsa di marcatori nel sangue. Il deflusso dalle cellule di grandi molecole proteiche (CC e LDH) può verificarsi solo se l'integrità della membrana plasmatica dei miociti è disturbata a causa della loro morte durante l'anossia. Le più piccole molecole di marcatori proteici (mioglobina, troponina) possono scadere in piccola quantità dalle cellule e in condizioni di ipossia prolungata con marcati cambiamenti nella membrana dei miociti, prima della distruzione delle cellule. Nelle prime 4 ore dopo l'occlusione dell'arteria coronaria nella zona di ischemia massima, circa il 60% dei miociti necrotizza; necrosi del restante 40% si verifica entro le prossime 20 ore.

Oltre la membrana del miocita, le molecole proteiche entrano nel fluido extracellulare e fluiscono dal cuore solo attraverso i dotti linfatici. Ciò determina un periodo di tempo piuttosto lungo (3-6 ore) dal momento della morte dei miociti alla comparsa di marcatori cardiospecifici nel sangue. Prima di tutto, il contenuto di mioglobina, GF-BB e troponina aumenta nel sangue, quindi - KK e l'isoenzima cardiocircolatorio KK-MB, AST; significativamente più tardi aumenta l'attività di LDH e isoenzima LDH cardiaco-specifico1 (Fig. 4.1). La sensibilità clinica dei marcatori cardiospecifici dipende in larga misura dal tempo trascorso dalla morte dei miociti. Quindi, per KK-MB, quando si rileva il sangue nelle prime 3-4 ore dopo un attacco di angina, la sensibilità clinica (accuratezza diagnostica) è solo del 25-45% e aumenta al 98% nel range di 8-32 ore.

Fig. 4.1. Dinamica dell'attività enzimatica nell'infarto miocardico. 1 - MW-2 / MW-1; 2 - MM-3 / MM-1; 3 - KK-MB; 4 - totale KK; 5 - LDH1/ LDG2

CK dà risultati falsi negativi nel 32% dei casi, AST - nel 49%, mioglobina - nel 15%. L'attività LDH è un marker affidabile di morte dei miociti dopo 12 ore dall'inizio di un attacco di angina, ma rimane elevata per 10-12 giorni. I dati sull'attività dei marcatori cardiospecifici in termini di meno di 4-6 ore dopo un attacco di angina pectoris possono portare a errori diagnostici, quando anche con marcatori di infarto miocardico di morte dei miociti non sono così istruttivi. Inoltre, il tasso di aumento del contenuto di marker cardiaci nel sangue dipende in gran parte dalla durata dell'ischemia e dal tempo di ricanalizzazione dell'arteria coronaria trombizzata e dalla riperfusione del miocardio dopo un attacco di cuore.

La seconda caratteristica del rilascio di marcatori di morte di cardiomiociti nel sangue è la dinamica caratteristica di aumento e diminuzione della loro concentrazione (concentrazione catalitica). Ciò è determinato dalla costante contrazione del miocardio, che porta prima alla rapida eliminazione delle proteine ​​dall'area necrotizzata del miocardio, e quindi alla completa lisciviazione delle proteine ​​marcatori nel flusso sanguigno. Solo nell'infarto del miocardio, il contenuto dei marcatori di morte dei cardiomiociti nel sangue aumenta nel range di 8-24 ore. Nel caso di infarto miocardico non complicato, vi è un'eliminazione marcatamente simile delle proteine ​​marcatori dal letto vascolare. Allo stesso tempo, il contenuto di ciascuno dei marcatori "scrive" una curva dinamica arcuata con diversi parametri temporali. Per la maggior parte dei marcatori, l'area della curva dà un'idea della grandezza dell'infarto del miocardio, che riflette la quantità di tessuto miocardico necrotico. L'attività nel sangue di CC e CC-MB è aumentata già con la morte di 1 g di tessuto miocardico.

Un singolo studio di AST, KK o LDH ha una specificità clinica relativamente bassa - il 66%, aumentando l'attività degli enzimi o il contenuto dei marcatori proteici in 3-4 ore aumenta la specificità dell'organo della diagnosi fino all'86%, la terza misura consente di diagnosticare l'infarto del miocardio usando anche un test così specifico come definizione di AST. Lo studio dinamico dei marcatori di morte dei miociti consente una diagnosi differenziale tra infarto del miocardio e iperfermentemia con massiva lesione dei muscoli striati. Nei periodi di 8-24 ore dopo un attacco di stenocardia, l'attività degli enzimi è così indicativa che se non c'è un aumento dinamico della loro attività nel sangue, allora non c'è infarto del miocardio.

Marcatori assolutamente specifici del danno cardiomiocitario non sono stati trovati. La specificità d'organo nella diagnosi con l'aiuto degli isoenzimi del QA si basa solo sulla differenza del rapporto percentuale degli isoenzimi nei singoli organi e tessuti e, di conseguenza, nel siero del sangue quando sono danneggiati.

Il valore di QC-MB. L'isoenzima KK-MB è specifico per il miocardio non perché non esiste un tale isoenzima in altri tessuti, ma perché la sua attività nei cardiomiociti è del 15-42% dell'attività totale del QC, mentre il suo contenuto nel tessuto muscolare scheletrico non supera il 4%, e solo in rosso, fibre muscolari che si contraggono lentamente. In queste condizioni, con la sconfitta del miocardio e dei muscoli scheletrici, l'attività CC può essere aumentata nella stessa misura, ma in termini percentuali l'attività di CC-MB differirà in modo significativo. Nell'infarto del miocardio, il contenuto di CK-MB supera il 6% dell'attività totale di CK o 12 UI / la temperatura di 30 ° C.

Sia nella patologia dei muscoli scheletrici che nella morte dei cardiomiociti nel sangue, l'attività di KK-MB è aumentata, ma nel primo caso la sua attività non supererà il 6% dell'attività di KK e nel secondo caso aumenterà fino al 12-20%. È consigliabile esprimere l'attività di QC-MB contemporaneamente in unità di 1 litro (IU / l) e come percentuale dell'attività di QC. La determinazione dell'attività di KK-MB rimane il test più popolare nella diagnosi di infarto del miocardio. Nell'infarto del miocardio in pazienti anziani, l'attività di controllo di qualità può essere aumentata solo in piccola parte, ma con un aumento significativo dell'attività di QC-MB. In tali pazienti, è diagnosticamente importante investigare l'attività di CK-MB, anche con un aumento non così significativo dell'attività di CK.

Durante le operazioni sul cuore (difetti cardiaci, intervento di bypass delle arterie coronarie), l'attività QC-MB viene utilizzata per diagnosticare l'infarto del miocardio postoperatorio. Immediatamente dopo l'intervento chirurgico, a causa di ipossia e danno miocardico, l'attività di KK-MB nel sangue aumenta e ritorna normale entro 10-12 ore. Con lo sviluppo dell'infarto miocardico, l'attività di KK-MB aumenta in modo più significativo e ha le caratteristiche dinamiche dell'infarto del miocardio.

Il valore di LDH. Attività LDH1 caratteristica del miocardio come tessuto con tipo di scambio anaerobico. In condizioni di ipertrofia miocardica e ipossia cronica, sintesi di LDH1 nei cardiomiociti inizia ad aumentare. Nell'infarto del miocardio, un aumento della concentrazione catalitica di LDH nel sangue si verifica a causa di un aumento di

contenuto di isoenzimi LDH1 e LDH2 a rapporto LDH1/ LDG2 più di 1. LDH - enzima citosolico; Un aumento significativo dell'attività LDH nel sangue durante l'infarto miocardico si verifica più tardi di QC e AST, durante 1 giorno il campo di attacco di angina; alta attività LDH1 persiste per 12-14 giorni. È la diminuzione dell'attività del LDH nel sangue alla normalità come test, che indica il completamento del periodo di riassorbimento del tessuto miocardico necrotizzato. Se l'attività di LDH1, determinato dal metodo diretto, con l'inibizione della subunità da parte degli anticorpi M supera 100 IU / l, questo è un segno affidabile di infarto del miocardio.

In contrasto con la subunità M e gli isoenzimi LDH3 (MMNN) LDH4 (HMMM) e LDH5 (MMMM) subunità H e LDH isoenzima1 (IUUH) in misura minore LDH2 (НННМ), può utilizzare non solo lattato e piruvato, ma α-idrossibutirrato come substrato. Questa era la base della proposta per valutare l'attività di LDH1 nel sangue, usando α-idrossibutirrato come substrato; mentre l'isoenzima LDH1 denominato α-idrossibutirrato deidrogenasi (α-HBDG). Nell'infarto del miocardio, uno studio dell'attività di LDH totale e α-HBDG dà risultati simili. Se l'attività di LDH nel sangue aumenta come risultato di un altro processo patologico, l'attività di LDH sarà significativamente superiore all'attività di LDH1 e α-HBDG in assenza di caratteristiche dinamiche dell'infarto del miocardio.

Nell'infarto del miocardio, non vi era correlazione significativa tra KK-MB e attività LDH.1 in tutti i termini di infarto, che si verifica a causa di una differenza significativa nelle dinamiche e nei tempi di un aumento dell'attività di questi isoenzimi nel sangue.

Molecole di enzimi che sono entrati nel sangue dopo la morte dei cardiomiociti sono componenti patologici del plasma sanguigno e pertanto devono essere rimossi. A seconda della dimensione delle molecole marcatore, alcune proteine, come la mioglobina, vengono escrete nelle urine o cellule fagocitiche del sistema monocito-macrofagi. Tuttavia, prima che le molecole CK-MB e CK-MM siano fagocitate dai macrofagi, subiscono un'azione sequenziale delle proteasi nel sangue, con conseguente formazione di isoenzimi CK-MB e CK-MM.

Nei miociti, l'isoenzima KK-MM è rappresentato da una singola forma di MM-3. Nel sangue, carbossipeptidasi scinde sequenzialmente i residui amminoacidici finali della lisina da ciascuno dei due monomeri, formando successivamente le isoforme MM-2 e MM-1. Determinazione delle isoforme di KK-MM e KK-MB mediante il metodo di EF e calcolo del loro rapporto

consentire fino a 1 ora di stabilire l'ora della morte dei cardiomiociti. Il rapporto tra le isoforme MM e MB cambia prima che l'attività di KK-MB aumenti.

L'enzimodiagnosi dell'infarto del miocardio nei laboratori diagnostici clinici è complessa. Determinare innanzitutto l'attività di AST, KK e LDH, quindi analizzare l'attività di KK-MB e LDH1. Un approccio integrato alla diagnostica enzimatica è dovuto, in primo luogo, al fatto che quando si studia l'attività di un singolo enzima, si può commettere un errore; in secondo luogo, ciascuno di questi enzimi differisce per significatività diagnostica e dinamica (il tempo di comparsa nel sangue e il tasso di eliminazione dal letto vascolare). Oltre alle imprecisioni che possono essere fatte a livello preanalitico (prelievo di sangue per analisi) e fasi analitiche, vi sono ragioni oggettive che influenzano i risultati della determinazione dell'attività degli enzimi. Le difficoltà insorgono quando l'infarto miocardico si sviluppa sullo sfondo di gravi malattie somatiche, con infarto miocardico complicato da shock cardiogeno, con setticemia.

Nonostante la specificità clinica dell'attività di QC per infarto del miocardio (98%), in alcuni casi, un aumento dell'attività di QC e QC-MB non è possibile rilevare anche nelle condizioni di verifica della diagnosi di infarto miocardico secondo i dati ECG. Ciò si verifica nei casi in cui l'infarto si sviluppa sullo sfondo dell'insufficienza renale e dell'accumulo di tossine uremiche (peptidi molecolari medi), in pazienti con cirrosi epatica e carente attività detossificante degli epatociti, con setticemia ed intossicazione endogena, con marcata acidosi metabolica (o respiratoria). In queste condizioni, un numero così elevato di inibitori non specifici si accumula nel sangue che l'attività di QC e QC-MB è praticamente indeterminata. In tali casi, è possibile determinare l'attività di QC solo dopo la procedura di diluizione sierica impopolare in biochimica clinica, quando una diminuzione della concentrazione di inibitori consente all'attività dell'enzima di comparire.

La presenza di inibitori KK e KK-MB nel sangue ha portato allo sviluppo di un metodo immunochimico per determinare nel sangue non l'attività catalitica, ma il contenuto di KK-MB per il peso molecolare di questa forma. Ciò ha significativamente migliorato la sensibilità del metodo e la riproducibilità dei risultati. Sebbene con infarto miocardico non complicato, l'attività di KK-MB e il contenuto di proteine ​​KK-MB sono correlati bene,

è possibile determinare il contenuto di QC-MB nel sangue diverse ore prima di quando l'enzima è attivo. Un aumento significativo del livello ematico della proteina CK-MB è stato osservato in metà dei pazienti già dopo 3 ore e 6 ore dopo un attacco di angina pectoris, un livello elevato di proteine ​​è stato osservato in tutti i pazienti con un quadro clinico di infarto miocardico. Già 90 minuti dopo la trombolisi, il livello della proteina KK-MB nel sangue aumenta più volte. Nei pazienti con angina instabile, un aumento del contenuto della proteina CC-MB è notato più spesso di un aumento dell'attività dell'isoenzima. Allo stesso tempo, nonostante la produzione di kit diagnostici da parte di diverse aziende, la questione della standardizzazione del metodo per determinare il numero di QC-VM non è stata finalmente risolta.

Il valore della glicogeno fosforilasi. Tra i marcatori enzimatici e isoenzimatici nella diagnosi di infarto miocardico, i biochimici clinici determinano l'attività di GF e il suo isoenzima GF-BB. GF è un enzima citosolico che catalizza la rimozione del glucosio dal glicogeno in una cellula.

Nei tessuti umani ci sono tre isoenzimi GF: GF-LL nel fegato, GF-MM nei miociti e GF-BB nel tessuto cerebrale. Gli isoenzimi GF-BB e GF-MM sono presenti nel miocardio umano, solo GF-MM è presente nei miociti dei muscoli scheletrici. GF-BB è il test più sensibile per la diagnosi di infarto miocardico nelle prime 3-4 ore dopo un attacco di angina. Secondo la sensibilità diagnostica nelle prime ore, la determinazione dell'attività GF può essere confrontata solo con la determinazione della massa KK-MB nel sangue. Nella maggior parte dei pazienti, il livello di GF-BB aumentava significativamente già dopo 4 ore dopo un attacco di angina e con infarto miocardico non complicato riportato alla normalità entro 48 ore.

Il valore di mioglobina. Tra i marcatori proteici dell'infarto del miocardio, la definizione più utilizzata nel sangue è il contenuto di mioglobina (MG). La MG è una cromoproteina, che nel citosol di tutte le cellule muscolari trasporta l'ossigeno principalmente ai mitocondri. La massa molecolare di MG è solo di 18 kD; le sue proprietà sono simili nei miociti e nei cardiomiociti dei muscoli scheletrici. La MG è costantemente presente nel plasma sanguigno ad una concentrazione inferiore a 80 ng / ml. Con l'infarto del miocardio, il livello di MG nel sangue aumenta di 10-20 volte.

• Aumento della MG nel sangue: il primo test per la diagnosi di infarto miocardico; aumento del livello di MG nel sangue può essere determinato dopo 3-4 ore dopo un attacco di angina. Questo è il primo valore diagnostico di MG.

• La seconda caratteristica di MG nella diagnosi di infarto del miocardio è che una tale piccola molecola passa liberamente attraverso la barriera di filtrazione dei corpi renali e finisce rapidamente nelle urine. Questo determina la natura dei cambiamenti nel contenuto di MG nel sangue: aumenta rapidamente e diminuisce altrettanto rapidamente. Solo quando si determina MG, è possibile diagnosticare infarti miocardici ricorrenti (Fig. 4.2), che si sviluppano alcune ore dopo il primo episodio della morte dei cardiomiociti. Inoltre, in una serie di osservazioni cliniche, sono state osservate fluttuazioni significative del livello di MG nel sangue il 1 ° giorno di infarto miocardico, quando un marcato aumento in poche ore ha dato luogo a una diminuzione altrettanto pronunciata. Β In alcune situazioni, il livello di MG nel sangue rimane per lungo tempo costantemente alto. Questo è osservato nello shock cardiogeno, quando una diminuzione della funzione contrattile porta a ipotensione, una caduta della pressione idrostatica sulla membrana renale e la cessazione

Fig. 4.2. Dinamica della concentrazione di mioglobina nel sangue dopo un attacco ripetuto di angina pectoris

filtrazione glomerulare, quando MG non può essere filtrato nelle urine. Allo stesso tempo, c'è una correlazione positiva tra il contenuto di MG nel sangue correlato positivamente con un aumento del livello di creatinina.

La principale unità contrattile strutturale del miocita è il sarcomero, che è formato da fibre spesse e sottili ordinate. Le fibre sottili contengono actina e il complesso troponina-tropomiosina.

Il valore di troponina. Il complesso regolatore della troponina nei muscoli striati è costituito da tre polipeptidi; Nella diagnosi di infarto miocardico, il contenuto di solo troponina T (Tn T) e troponina I (Tn I) è determinato nel sangue. Ogni proteina ha tre isoforme, la cui sintesi è codificata da tre diversi geni. Le isoforme miocardiche di Tn T e Tn I (cuore Tn T e cuore Tn I) sono utilizzate come marcatori specifici della morte dei cardiomiociti.

La determinazione del contenuto di Tn T consente la diagnosi di infarto sia in fase precoce che tardiva. Il contenuto di Tn T nel sangue sale dopo poche ore dopo un attacco di angina. Nelle prime fasi dell'infarto miocardico, la sensibilità clinica alla determinazione del contenuto di mioglobina e KK-MB è superiore a Tn T, ma a partire dal 3 ° giorno il livello Tn raggiunge un plateau, che persiste con una diminuzione graduale per 5-6 giorni. Il livello di Tn risulta essere elevato in quei periodi di infarto miocardico non complicato, quando il livello di mioglobina e attività di KK-MB è già tornato alla normalità, e solo l'attività LDH alta rimane nel sangue.1. In alcuni casi, quando si determina Tn T, la diagnosi di infarto miocardico può essere fatta in un secondo momento - 8-10 giorni dopo il dolore anginoso. È particolarmente importante indagare su TI in pazienti che sono stati ricoverati in ospedale 2-3 giorni dopo un attacco di angina, quando gli indicatori KK e KK-MB possono già tornare al loro livello normale originale. Inoltre, rispetto a KK e KK-MB, il contenuto di Tn T nel sangue aumenta in misura maggiore, il che caratterizza la maggiore sensibilità diagnostica della determinazione del contenuto di Tn T nel sangue.

Uno studio comparativo di Tn T e Tn I ha rivelato una maggiore sensibilità diagnostica di Tn I. Quindi, il livello di Tn I nel sangue durante l'infarto miocardico può essere quasi 100 volte superiore al limite superiore del normale. Con un piccolo infarto miocardico, il livello di Tn I nel sangue aumenta in misura maggiore rispetto all'attività di CC,

Tabella 4.1. Caratteristiche comparative dei marker sierici cardiaci

una percentuale o un rapporto di QC-MB / totale. QC 6 Il tempo dall'inizio dell'attacco doloroso dipende dal metodo

KK-MB e LDG1. La determinazione di entrambe le forme di Tn T e Tn I è preferibile nella diagnosi di infarto del miocardio, che si sviluppa nel periodo postoperatorio e dopo misure di rianimazione attive.

Non esiste un indicatore ideale dello stato dei cardiomiociti (Tabella 4.1). Nella diagnosi di infarto del miocardio, i biochimici clinici tendono a utilizzare gli isoenzimi più specifici dell'organo e identificano i marcatori proteici contenenti solo cellule miocardiche. Tuttavia, per la diagnosi di infarto miocardico nei laboratori continuano a determinare e MG. Tuttavia, con un infarto del miocardio non complicato, la dinamica di MG non specifica nel sangue praticamente ripete quella del CK-MB cardiospecifico, essendo 4-6 ore più avanti di esso.Allo stesso tempo, i tentativi di determinare il contenuto di MG nelle urine per la diagnosi di infarto miocardico non hanno avuto successo.

4.2. MALATTIE DEL FEGATO

Nonostante i numerosi processi biochimici che si verificano nelle cellule del fegato, non tutti hanno un valore diagnostico. Ciò è dovuto alle limitate capacità metodologiche del laboratorio, al basso livello di conoscenza della fisiopatologia del fegato e ai cambiamenti unidirezionali in numerosi test biochimici.

Il valore dominante nella diagnosi di laboratorio della malattia epatica è la determinazione dell'attività enzimatica. Gli enzimi sintetizzati dagli epatociti e le cellule epiteliali dei dotti biliari possono essere divisi in indicatori, secretori ed escretori. Gli enzimi secretivi includono la colesterasi, la sua attività nel sangue nelle malattie del fegato diminuisce a causa di una violazione della sua sintesi. Da enzimi escretori includono fosfatasi alcalina, GGT e PAWS. Il più grande gruppo di enzimi diagnosticamente importanti sono gli enzimi indicatori, tra cui ALT, AST, LDH e GLDH. Nella tab. 4.2 mostra gli enzimi indicati e la loro distribuzione intracellulare.

Diffuso nella diagnosi differenziale della malattia epatica ha ricevuto un metodo per confrontare il grado di aumento dell'attività degli enzimi con diversa localizzazione negli epatociti e che riflette i diversi lati dell'attività funzionale delle lesioni cellulari. La proporzione più utilizzata di enzimi è presentata in tabella. 4.3.

Tabella 4.2. Enzimi epatici

Tabella 4.3. Il rapporto degli enzimi epatici

Per le malattie del fegato, utilizzare il coefficiente di De Ritis (rapporto di attività AST / ALT). Il rapporto AST / ALT di più di 2 è tipico per le lesioni indotte dall'alcol e inferiore a 1 per l'epatite virale e la sindrome colestatica. Nella maggior parte dei casi di epatite virale, il rapporto AST / ALT è rimasto sotto 1. Con l'epatite virale, l'attività ALT aumenta di dieci volte. Nell'attività epatica acuta di epatite AST è superiore a ALT, mentre l'attività di entrambi gli enzimi non supera i 500-600 UI / L. I pazienti con epatite tossica, mononucleosi infettiva, colestasi intraepatica, cirrosi, metastasi epatiche, attività di AST da infarto miocardico sono superiori all'attività ALT. L'attività di ALT e AST aumenta durante l'assunzione di eritromicina, acido para-aminosalicilico, chetoacidosi diabetica, psoriasi, è anche usato per la diagnosi precoce di epatite anterterica.

Nella diagnosi differenziale della patologia epatica, è importante indagare i rapporti dell'attività degli isoenzimi LDH. L'aumento dell'attività relativa dell'isoenzima LDH5 caratteristica delle lesioni degli epatociti. L'iperfermentemia LDH è osservata a vari livelli in epatite virale acuta, farmaco e ipossia, insufficienza cardiaca, cirrosi epatica e colestasi extraepatica, oltre a una diminuzione della resistenza osmotica degli eritrociti e dell'emolisi. Aumento a lungo termine dell'attività degli isoenzimi LDH5 e LDH4 suggerisce la presenza di metastasi epatiche.

Attualmente, nella diagnosi delle malattie del fegato, la stabilità dei sistemi colloidi è ancora valutata mediante test timolo e sublimato. I risultati patologici riflettono i primi periodi di epatite acuta, danno epatico tossico, esacerbazione dell'epatite cronica. Le proteine ​​ESP sieriche di sangue forniscono anche dati non specifici, ma consentono di giudicare la natura del processo patologico. La percentuale di albumina, proteine ​​in fase acuta e γ-globuline aiuta nella diagnosi della patologia epatica: l'albumina bassa e gli alti livelli di γ-globuline sono caratteristici della cirrosi epatica. Aumento dei livelli ematici di γ-globuline si trovano anche nell'infiltrazione grassa del fegato, nell'infiammazione dei dotti biliari e nella malignità.

Il contenuto di albumina nel siero ha un valore diagnostico nelle forme acute e croniche di epatite. In tutti i casi di epatite acuta, il livello di albumina nel sangue rimane normale.

L'epatite cronica è accompagnata da ipoalbuminemia e ipergammaglobulinemia.

Il fegato è il collegamento centrale nella regolazione della coagulazione del sangue. Gli epatociti sintetizzano il fibrinogeno, molti attivatori e inibitori di una cascata di reazioni enzimatiche. Sia l'epatite acuta sia quella cronica interrompono questo regolamento. I test diagnostici per le malattie del fegato comprendono l'allungamento del tempo di protrombina, l'accumulo nel sangue dei prodotti di distruzione del fibrinogeno. Il danno epatico acuto è accompagnato da un aumento del sanguinamento in condizioni di ipofibrinogenemia.

La compromissione della funzionalità epatica è accompagnata da un cambiamento nel metabolismo dell'LP. L'ipertrigliceridemia è caratteristica di varie forme di patologia epatica. L'ipercolesterolemia si verifica spesso quando i dotti biliari sono ostruiti e ittero ostruttivo. Nell'epatite cronica, il colesterolo libero si accumula nel sangue come risultato di una diminuzione della sua esterificazione nel sangue. In condizioni di colestasi pronunciata, si osserva la formazione di forme macroscopiche colestatiche LP-LP-X, che forma un complesso di LP con un frammento della membrana plasmatica.

Nella maggior parte dei casi di malattia epatica, il fattore eziologico rimane oltre la portata della diagnosi e i biochimici clinici formano una diagnosi basata sui principi della diagnosi sindromica.

I principali processi patologici che formano la diagnosi di laboratorio della malattia sono le seguenti sindromi:

• colestasi intraepatica ed extraepatica;

• lesioni tossiche da epatociti;

• insufficienza di processi sintetici negli epatociti;

• rallentare l'inattivazione dei composti tossici;

Sindrome da citolisi La base patofisiologica della sindrome citolitica è una violazione dell'integrità della membrana plasmatica degli epatociti e dei loro organelli con lo sviluppo di iperfermentemia. L'iperfermentemia severa quando gli enzimi citosolici entrano nel flusso sanguigno è caratteristica dell'epatite infettiva, del danno epatico medicinale e tossico, dell'avvelenamento, della cirrosi scompensata e dell'infiammazione perifarica del parenchima nella colangite. Nell'enzimodiagnosi della sindrome citolitica domina la definizione

Attività ALT, AST e LDH. Normalmente, l'attività di ALT e AST nel sangue non supera 24 IU / l; entro 100 IU / L, l'iperfermentemia è considerata come una "zona grigia", che può essere dovuta a cambiamenti reattivi negli epatociti. L'attività ALT superiore a 100 IU / l indica danni al parenchima epatico. L'aumento dell'attività dell'ALT in 100-200 volte (fino a 2-6 mila UI / l) riflette l'esteso danno degli epatociti nell'epatite virale e l'avvelenamento con solventi organici.

Sindrome di colestasi intraepatica ed extraepatica. La sindrome da colestasi intraepatica determina la violazione del deflusso della bile dal fegato. L'aumento del volume degli epatociti porta alla compressione dei dotti biliari, compromessa funzione di drenaggio. L'otturazione dei grandi dotti biliari è la causa della colestasi extraepatica; colestasi più pronunciata con ittero ostruttivo. Nella tab. 4.4 mostra la combinazione di test di laboratorio più comunemente utilizzati per la diagnosi differenziale di colestasi.

Tabella 4.4. Diagnosi di colestasi

I marcatori affidabili della colestasi intraepatica sono un aumento dell'attività di ALP, GGT e 5-nucleotidasi nel sangue. Nella membrana epiteliale del dotto biliare, gli enzimi si trovano vicini l'uno all'altro, quindi, con la distruzione delle membrane, la loro attività nel flusso sanguigno aumenta simultaneamente e in modo uguale.

I cambiamenti reattivi nell'epitelio delle vie biliari e delle membrane plasmatiche degli epatociti sono valutati in base all'attività della fosfatasi alcalina. L'attività della fosfatasi alcalina aiuta nella diagnosi differenziale della colestasi intraepatica ed extraepatica. Durante l'ostruzione extraepatica (calcoli dei dotti biliari, neoplasie della papilla Vater), l'attività alcalina del fosforo aumenta di 10 volte o più. L'ostruzione intraepatica nelle lesioni parenchimali (epatite) è accompagnata da

è un aumento dell'attività della fosfatasi alcalina di 2-3 volte. La necrosi acuta degli epatociti può non essere accompagnata da un aumento dell'attività della fosfatasi alcalina se questo non causa la compressione dei dotti biliari (colestasi intraepatica). Non tutti i processi patologici nel fegato osservano la dipendenza tra l'attività della fosfatasi alcalina e l'iperbilirubinemia. Nelle prime fasi della colestasi intraepatica, l'aumento dell'attività della fosfatasi alcalina è una conseguenza dell'attivazione della sua sintesi; inoltre il suo aumento è associato alla distruzione dei canalicoli della bile sotto l'azione degli acidi biliari.

Sindrome di colestasi intracellulare. Un aumento delle dimensioni degli epatociti e la loro compressione dei dotti biliari tra i segmenti del fegato porta alla comparsa della sindrome della colestasi intracellulare con un moderato aumento dell'attività della fosfatasi alcalina e GGT nel sangue e danni all'epitelio dei dotti biliari. Un aumento del contenuto ematico di acidi biliari è anche un sintomo precoce della colestasi.

Un sintomo comune di malattia del fegato accompagnato da colestasi è l'accumulo di bilirubina nel sangue. La gravità dell'iperbilirubinemia non è attendibile per la diagnosi differenziale di colestasi intraepatica ed extraepatica. Allo stesso tempo, l'iperbilirubinemia ha un valore prognostico. Un aumento del livello di bilirubina è cinque volte tipico per la colestasi intraepatica, un aumento della concentrazione di bilirubina è 10 volte più caratteristico dell'epatite acuta.

La sindrome da danno tossico agli epatociti si sviluppa, ad esempio, durante l'intossicazione alcolica, quando gli effetti della citolisi sono assenti, ma l'alcol viola la funzione dei mitocondri.

Nell'intossicazione acuta da alcol si sviluppa una sindrome da danno tossico alle formazioni subcellulari e l'integrità delle membrane plasmatiche negli epatociti non è compromessa. I metaboliti di alcol hanno un effetto tossico, in particolare l'acetaldeide, che si forma direttamente nei mitocondri. Allo stesso tempo, la formazione di composti ad alta energia, in particolare l'ATP, è compromessa nella cellula, che ha un effetto patologico sui processi di detossificazione dei composti tossici. Nel periodo acuto di epatite alcolica, l'attività di AST può dominare nel sangue a causa dell'alta attività dell'isoenzima AST mitocondriale, non del citoplasma.

Il coinvolgimento degli epatociti nel processo patologico dei mitocondri è accompagnato dalla comparsa di attività GlDG nel sangue. L'aumento dell'attività di GlDG è un test dell'epatite alcolica precoce, ma un aumento di 8-10 volte dell'attività di GlDG con attivazione moderata di AST e ALT è caratteristico dell'ittero ostruttivo. Per tossico

gli effetti dell'alcol sono caratterizzati da un pronunciato aumento dell'attività del sangue del GGT senza un significativo aumento dell'attività della fosfatasi alcalina.

Insufficienza della sindrome dei processi sintetici si manifesta nella diminuzione della sintesi di proteine ​​di trasporto degli epatociti, proteine ​​del sistema di coagulazione del sangue, CE.

Lui e i suoi isoenzimi sintetizzano gli epatociti. In condizioni di lesione parenchimale, la sintesi di ChE e la sua attività nel sangue è ridotta. Più spesso, una diminuzione del sangue CE si verifica a causa di effetti tossici (citostatici, insetticidi, fungicidi, fluoruri). Il declino fisiologico dell'attività del CE si verifica durante la gravidanza. I casi rari di diminuzione geneticamente determinata nella sintesi di CHE sono annotati.

In caso di insufficienza epatica acuta, l'ipoglicemia si sviluppa in ogni 4 ° paziente. In condizioni di accumulo di metaboliti intermedi e lo sviluppo di insulino-resistenza, è anche possibile la presenza di iperglicemia. Con insufficienza epatica a lungo termine, si verifica iperinsulinemia (riducendo la distruzione dell'ormone nel fegato). In condizioni di ipossia e attivazione della glicolisi anaerobica, l'acidosi metabolica si forma con l'accumulo di acido lattico nel sangue (acidosi del lattato). L'acidosi metabolica porta a una violazione del rapporto degli elettroliti. La sconfitta del parenchima epatico è accompagnata da una diminuzione della formazione di creatinina e urea. Naturalmente, l'apporto proteico inadeguato e i disturbi digestivi contribuiscono a questo. Tuttavia, la causa principale dell'ipocreatinemia è una diminuzione della sintesi di creatinina negli epatociti. Nei pazienti con epatite, l'ipocreatinemia è associata a una diminuzione del livello di acido urico nel sangue.

La sindrome di rallentare l'inattivazione dei composti tossici è dovuta all'inibizione della loro idrossilazione nell'apparato microsomiale degli epatociti, che riduce il tasso di inattivazione nel corpo di molti farmaci. In queste condizioni, anche una dose terapeutica bassa del farmaco può causare un effetto collaterale pronunciato.

Il fegato funge da barriera biologica di composti tossici endogeni ed esogeni, che provengono principalmente dal tratto gastrointestinale. La valutazione della funzione di disintossicazione del fegato è più spesso effettuata con lesioni croniche che utilizzano test di stress con galattosio, acido fenoletrabromoftalfenolfonico, bromocianovym verde, composti marcati. I test di carico offrono l'opportunità di diagnosticare forme croniche della malattia, da valutare

effetti residui dell'epatite trasferita, per formarsi un'idea sulla funzione del fegato nella cirrosi, infiltrazione grassa del fegato.

In situazioni gravi di coma epatico nell'epatite virale acuta o ipertensione portale, la funzione di disintossicazione del fegato viene valutata in base alla quantità di ammoniaca presente nel sangue. La formazione di ammoniaca nell'intestino avviene costantemente a causa dell'attività vitale dei microrganismi e della deaminazione degli aminoacidi formati dalle proteine ​​alimentari. Tra un massiccio sanguinamento dallo stomaco o le vene dell'esofago, c'è una maggiore formazione di ammoniaca da albumina del sangue.

La sindrome infiammatoria è causata dall'attivazione delle cellule RES. È caratterizzato da un aumento del contenuto ematico delle proteine ​​della fase acuta, daproproteinemia in violazione del rapporto delle proteine ​​sieriche su elettroforegramma, una variazione nei campioni di sedimento (timolo), un aumento della concentrazione di immunoglobuline.

Nonostante la diversità di questi disturbi, l'uso delle tecniche di diagnosi sindromica è efficace già nelle prime fasi della malattia epatica. Naturalmente, i risultati degli studi biochimici nel processo diagnostico non sono unici. Allo stesso tempo, i medici usano i dati dell'anamnesi e dell'esame obiettivo, i risultati della diagnostica dei radionuclidi, la tomografia computerizzata e la biopsia epatica. Allo stesso tempo, la diagnostica differenziale nelle prime fasi della malattia e una valutazione della natura del danno agli epatociti possono essere eseguite solo sulla base di test di laboratorio, principalmente dati dalla biochimica clinica. Le combinazioni utilizzate di studi di laboratorio sono presentate in Tabella. 4.5.

Tabella 4.5. Diagnosi di malattie del fegato da enzimi

4.3. PATOLOGIA DEL TESSUTO OSSEO

I principali fattori che regolano il metabolismo del fosfato e del calcio includono PTH, calcitonina e vitamina D. PTH e calcitonina mantengono la costanza del calcio nel letto vascolare e nel fluido extracellulare, influenzano l'assorbimento del calcio nell'intestino, il riassorbimento nei reni, l'intestino e la deposizione nel tessuto osseo. Il PTH regola il calcio nel sangue, influenzando l'assorbimento del calcio nell'intestino e nei tubuli renali, la mobilizzazione del calcio dal tessuto osseo. La calcitonina ha un effetto meno significativo, riduce l'attività degli osteoclasti, aumenta l'attività degli osteoblasti, portando ad una diminuzione del calcio nel sangue.

Il PTH è un polipeptide, la cui unica catena è costituita da 84 residui di aminoacidi. L'ormone secerne ghiandole paratiroidi, probabilmente nella forma di un precursore inattivo, da cui si forma l'ormone attivo scacciando il frammento polipeptidico. Il PTH attivo ha un'emivita breve, che crea problemi per l'analisi: utilizzando il metodo radioimmunologico, il frammento carbossi-terminale dell'ormone viene principalmente misurato, che ha un'emivita più lunga, ma è biologicamente inattivo.

Quando agisce sui reni, il PTH sopprime il riassorbimento del fosforo nei tubuli prossimale e distale del nefrone, aumentandone l'escrezione e, di conseguenza, abbassando il livello di fosforo nel sangue (ipofosfatemia). Allo stesso tempo, l'ormone aumenta il riassorbimento del calcio tubulare, specialmente nei tubuli distali del nefrone. L'azione del PTH nel tessuto osseo provoca la mobilitazione di calcio e fosfato, contribuendo alla comparsa di osteoporosi e ipercalcemia. L'ipocalcemia a feedback negativo è lo stimolo principale per la secrezione di PTH, mentre l'ipercalcemia sopprime la formazione dell'ormone da parte delle ghiandole paratiroidi. Il PTH aumenta anche l'assorbimento di calcio e fosforo nell'intestino, stimolando la sintesi di 1,25-diidrossicolecalciferolo.

Nei casi di ipersecrezione di PTH con adenoma paratiroideo, si sviluppa una pronunciata osteoporosi, con la presenza di

ipercalcemia e ipofosfatemia e aumento dell'escrezione di calcio e fosfato nelle urine. In queste condizioni, il riassorbimento del fosfato nei tubuli viene inibito e, di conseguenza, la sua escrezione aumenta, la clearance del fosfato aumenta con il verificarsi dell'ipercalcemia in condizioni di riassorbimento osseo con lo sviluppo dell'osteoporosi. È possibile confermare la diagnosi determinando la concentrazione di PTH nel sangue. Nei casi in cui l'ipofosfatemia è accompagnata da ipercalcemia, anche un moderato aumento del contenuto di ormoni è importante dal punto di vista diagnostico.

Va tenuto presente che in alcune forme di tumori polmonari, renali, ovaie, la formazione di PTH ectopico si verifica nelle cellule tumorali. Tra tali condizioni, è necessario differenziare la forma di rachitismo resistente alla vitamina D. Questa malattia ereditaria raramente legata al sesso è chiamata sindrome di Fanconi. Quest'ultimo è caratterizzato da un'elevata escrezione di fosforo nelle urine, contemporaneamente a glucosuria e aminoaciduria, senza che si verifichi l'acidosi nel sangue.

Nell'insufficienza renale cronica, l'attivazione della sintesi del PTH può verificarsi come meccanismo compensatorio nello sviluppo di ipocalcemia e iperfosfatemia. L'iperparatiroidismo secondario è anche osservato con l'osteomalacia, causata da una significativa diminuzione dell'assorbimento di calcio nell'intestino con aumento dell'escrezione.

Questa condizione patologica si sviluppa più spesso come complicanza della chirurgia sulla ghiandola tiroidea, quando le ghiandole paratiroidi vengono rimosse per errore. In questo caso, il livello di calcio nel sangue è così basso che si sviluppano i sintomi specifici di ipocalcemia e iperfosfatemia (sintomi di Khvostek e Trusso), l'escrezione di calcio e fosforo con diminuzione delle urine. Questa condizione richiede immediata somministrazione endovenosa di cloruro di calcio.

Nel quadro clinico dello pseudo-ipoparatiroidismo, la variazione dei livelli ematici di fosfato e calcio è simile a quella dell'ipoparatiroidismo primario, ma allo stesso tempo aumenta il contenuto di PTH nel sangue. Questo stato

caratteristica di una malattia genetica (malattia di Albright) associata all'incapacità delle cellule tubulari renali di rispondere a un ormone.

Il secondo ormone che regola il metabolismo del fosforo e del calcio è la calcitonina. Un peptide a catena singola con 32 residui di aminoacidi secerne cellule parafollicolari dei lobi laterali della tiroide. Questo ormone inibisce la mobilizzazione di fosfato e calcio, mentre il loro contenuto nel sangue diminuisce (ipocalcemia e ipofosfatemia). L'effetto dell'ormone sui reni non è ben compreso; la calcitonina è suggerita per aumentare l'escrezione tubulare dei fosfati. Inoltre, l'ormone inibisce l'effetto stimolante del PTH sulla sintesi del 1,25-diidrossi-aloalcalciferolo.

RUOLO DELLA VITAMINA D

Il terzo fattore che influenza attivamente il metabolismo del calcio e del fosforo nel tessuto osseo è la vitamina D. La sintesi della vitamina D nel corpo avviene in due fasi di idrossilazione: la prima si verifica nel fegato per formare una sostanza con un'attività biologica limitata; il secondo stadio avviene nei reni con la formazione di vitamina D3, colecalciferolo con la massima attività biologica. Vitamina D nell'intestino tenue3 stimola l'assorbimento di fosforo e calcio, nelle parti prossimali della parte tubulare del nefrone attiva il riassorbimento di entrambi gli ioni. Fattori che attivano la sintesi della vitamina D3 nei reni, c'è una diminuzione del contenuto di fosforo nel sangue e l'effetto del PTH.

In condizioni di carenza di vitamina D, a causa di una diminuzione del contenuto dei suoi precursori liposolubili nel cibo, insufficiente irradiazione ultravioletta della pelle o malassorbimento, marcata ipofosfatemia è annotata nel sangue. In risposta ad un aumento della secrezione di PTH, aumenta l'assorbimento di calcio e fosfato nell'intestino tenue e la mobilitazione di minerali dal tessuto osseo. Durante un periodo di tempo, questo normalizza il contenuto di calcio nel sangue, ma la concentrazione di fosforo può rimanere ridotta a causa dell'inibizione del suo riassorbimento da parte dell'ormone paratiroideo.

Nell'insufficienza renale cronica si sviluppa la sindrome dell'osteodistrofia renale - una complessa violazione del metabolismo del tessuto osseo e dell'omeostasi del fosforo-calcio. Diminuzione del glomerulare

la filtrazione produce iperfosfatemia, l'ipocalcemia si sviluppa con una diminuzione della sintesi renale di vitamina D e resistenza ai suoi effetti. L'iperfosfatemia può contribuire allo sviluppo di ipocalcemia a causa della diminuzione dell'assorbimento di calcio nell'intestino tenue, a causa della formazione di apatiti insolubili.

MALATTIE DEL TESSUTO D'OSSE METABOLICHE

Le malattie metaboliche delle ossa sono suddivise in osteoporosi, osteomalacia, osteodistrofia, osteogenesi imperfetta e osteoporosi. Le malattie ossee possono anche svilupparsi sullo sfondo di un'altra patologia, come acromegalia o calcificazione ectopica nella parete vascolare (con aterosclerosi e normale con formazione di "sabbia cerebrale" nell'epifisi).

L'osteoporosi è la più comune malattia ossea metabolica. L'osteoporosi è tipica di molte malattie, caratterizzata da una perdita generalizzata del tessuto osseo, che supera l'età e gli standard sessuali e porta ad una diminuzione della forza ossea, che causa la suscettibilità alle fratture (spontanee o con lesioni minime). L'osteoporosi deve essere distinta dall'osteopenia (atrofia legata all'età del tessuto osseo) e dall'osteomalacia (mineralizzazione compromessa della matrice ossea).

I fattori di rischio per l'osteoporosi includono l'appartenenza alla razza caucasoide o mongoloide, predisposizione familiare, peso corporeo inferiore a 58 kg, fumo e alcolismo, attività fisica bassa o eccessiva, menopausa precoce, insorgenza tardiva delle mestruazioni, amenorrea e infertilità, allattamento prolungato (più di 6 mesi) più di tre gravidanze e parto in età riproduttiva, così come l'abuso di caffè (più di cinque tazze al giorno), la mancanza di apporto di calcio dal cibo e la nutrizione parenterale prolungata.

Il quadro clinico nella maggior parte dei casi si sviluppa gradualmente, di solito per diversi anni. Nella diagnostica di laboratorio, è importante determinare il livello di fosfatasi alcalina (può transitoriamente aumentare dopo le fratture), calcio e fosfato (di solito normale). L'attività di riassorbimento osseo è determinata dal rapporto tra il livello di calcio delle urine e il livello di creatinina nelle urine e il rapporto tra il contenuto di idrossiprolina nelle urine e il livello di creatinina nelle urine. L'esame a raggi X della colonna vertebrale rivela una diminuzione della densità ossea con accentuazione

contorni corticali. L'aspetto sulla radiografia di tali deviazioni è possibile solo con la perdita di almeno il 30% del tessuto osseo.

L'osteomalacia è una patologia scheletrica che si verifica quando la matrice organica delle ossa è insufficientemente mineralizzata. Nei bambini, è rachitismo (vedi sotto), negli adulti, disordini metabolici di calcio, fosforo e vitamina D.

Rachitismo - una malattia della prima infanzia, derivante da carenza di vitamina D, caratterizzata da cambiamenti nel tessuto osseo con lo sviluppo di deformità scheletriche. Tutti i processi fisiopatologici sono causati dall'ipocalcemia a causa della carenza di vitamina D e dei suoi metaboliti. L'attivazione compensativa delle ghiandole paratiroidi e iperproduzione del PTH, che mobilita l'escrezione di calcio dalle ossa e aumenta l'assorbimento dei sali di calcio e fosfato nell'intestino, si verifica. Si verificano ipofosfatemia, acidosi metabolica e disturbi dell'osteogenesi.

L'osteodistrofia deformante (osteite deformante, malattia di Paget) è una malattia ereditaria caratterizzata da deformazione delle ossa femorali e tibiali, colonna vertebrale e cranio con grave iperostosi, ispessimento e curvatura delle ossa, aumento dell'incidenza di tumori. Di solito si verifica oltre i 50 anni. Il quadro clinico è solitamente asintomatico, la manifestazione più comune è il dolore alle ossa o alle articolazioni. Più raramente, si notano deformità ossee, mal di testa, fratture patologiche, un aumento della temperatura corporea sopra l'arto interessato, insufficienza cardiaca con alta gittata cardiaca e vari disturbi neurologici dovuti alla compressione del tessuto nervoso (con danno cranico, il più frequente di questi è la sordità). Laboratorio caratterizzato da un aumento del fosforo alcalino e dell'osteocalcina nella fase osteosclerotica, un aumento del livello di idrossiprolina nella fase osteolitica. Il calcio sierico e il fosforo sono normalmente normali.

L'osteodistrofia renale o uremica è un danno osseo comune, simile a osteomalacia, rachitismo o osteite fibrosa; notato in insufficienza renale cronica.

L'osteodistrofia ereditaria di Albright è dovuta alla resistenza delle cellule bersaglio all'azione del PTH (pseudoipoparatiroidismo). I pazienti con pseudoipoparatiroidismo sono resistenti ad altri ormoni che agiscono attraverso il sistema adenilato ciclasi.

(ormone stimolante la tiroide, glucagone, FSH, LH). In questi pazienti si osserva un fenotipo caratteristico, manifestato da brachidattilia, bassa statura, ossificazione sottocutanea. La malattia di Albright è spesso associata a diabete mellito, ipertensione arteriosa, obesità, disturbi mestruali (oligomenorrea), arterite, poliartrosi. Anche caratterizzato da ritardo mentale e convulsioni (a causa di ipocalcemia).

L'osteosintesi imperfetta è una malattia ereditaria che causa una diminuzione della massa ossea (a causa di una violazione dell'osteogenesi) e causa la loro maggiore fragilità; spesso accompagnato da scolorimento blu della sclera, anomalie dei denti (dentinogenesi imperfetta) e progressiva perdita dell'udito. L'ecografia rivela forme gravi del feto dalla 16a settimana di gravidanza. La diagnosi è possibile utilizzando gli studi sul DNA in campioni di biopsia del villi coriali. Trattamento sintomatico e ortopedico

L'osteoporosi e l'osteosclerosi sono concetti collettivi e, in pratica, identici che caratterizzano l'aumento relativo del contenuto di tessuto osseo delle ossa, che porta ad una diminuzione del volume delle cavità del midollo osseo con inevitabile compromissione della formazione del sangue.

Malattia di marmo Sono note diverse forme ereditarie: la malattia di Albers-Schoenberg ereditata dominante e le forme recessive sono forme maligne, benigne e letali. Frequenza tutte le forme - circa 1: 20.000 osteopetrosi clinicamente in questa patologia manifesta fratture multiple, osteomielite, hyperostosis cranio, rinite cronica dovuta a restringimento dei passaggi nasali, epatosplenomegalia (causate da compensativo ematopoiesi extramidollare), paralisi del nervo facciale, anemia (causata da una diminuzione nel volume del midollo osseo) e laboratorio - aumentando il livello di fosfatasi alcalina.

4.4. MARKER DELLA CRESCITA MALIGNITA

Non vi è dubbio che il successo del trattamento del cancro può essere previsto solo quando i tumori maligni vengono rilevati in una fase precoce dello sviluppo, tuttavia, la questione della tempestiva individuazione dei segni di tali patologie rimane ancora aperta.

Negli ultimi anni, le capacità diagnostiche degli oncologi clinici si sono notevolmente ampliate in relazione all'uso dei moderni metodi diagnostici strumentali: angiopatia e linfografia, diagnostica dei radionuclidi, computer

tomografi termografici e a raggi X, risonanza radio-magnetica, ultrasuoni con effetto Doppler, che permettono di ottenere un'immagine a colori del tumore e giudicare le caratteristiche del microcircolo. I moderni studi immunomorfologici e citologici consentono lo studio di campioni bioptici non solo del tumore stesso, ma anche di varie secrezioni (espettorato, urina, fluido ascitico). Attualmente, la complessa diagnostica biochimica e immunologica di laboratorio si basa sull'identificazione di marcatori tumorali, ormoni, composti biologicamente attivi, isoforme enzimatiche e metaboliti del rimodellamento osseo in caso di lesioni ossee metastatiche.

L'inizio dello studio dei marcatori tumorali è stato molto incoraggiante. Già alla fine del 19 ° secolo, le proteine ​​specifiche (immunoglobuline), che erano chiamate proteine ​​Bens-Jones, furono trovate nelle urine di pazienti con mieloma multiplo, ma il successo successivo dovette attendere più di 80 anni. È associato alla scoperta di GI. Abelev e Yu.S. Tatarina α-fetoproteina nel sangue di pazienti con epatoma. Questi studi hanno segnato l'inizio di una nuova fase nello studio dei fattori associati alla crescita dei tumori maligni e, nel XX secolo, hanno portato alla scoperta di una serie di composti diversi, chiamati "marker tumorali". I marcatori sono ampiamente utilizzati dai biochimici clinici per identificare il tumore primario e le sue metastasi. I marcatori di crescita maligna includono sostanze di diversa natura. Questi includono più di 200 composti: antigeni, ormoni, enzimi, glicoproteine, lipidi, proteine, metaboliti, la cui concentrazione è correlata con la massa tumorale, la sua attività proliferativa e in alcuni casi con il grado di malignità della neoplasia. L'espressione anormale del genoma è uno dei principali meccanismi di produzione dei marcatori da parte delle cellule tumorali, che determina la sintesi di proteine ​​embrionali, placentari ed ectopiche, enzimi, antigeni e ormoni.

Come test ideale per la diagnosi precoce dei tumori maligni, sono stati proposti molti marcatori, ma finora non è stata trovata alcuna soluzione. Difficoltà dovute alla diversità dei requisiti per un indicatore ideale. Il marcatore tumorale ideale dovrebbe essere prodotto dalla cellula tumorale in quantità sufficiente in modo che possa essere determinato utilizzando metodi moderni. Non dovrebbe essere presente nelle persone sane e nei tumori benigni,

il marker deve essere rilevato nelle prime fasi del processo tumorale, il numero del marker tumorale deve essere direttamente proporzionale al volume del tumore, questo marker deve essere determinato prima delle manifestazioni cliniche del tumore, il livello del marker ideale dovrebbe essere correlato con i risultati del trattamento antitumorale.

Negli studi clinici, viene utilizzato un numero di marcatori tumorali sufficientemente efficaci, che, tuttavia, non sempre soddisfano pienamente tutti i criteri di cui sopra. I moderni metodi biochimici e immunologici possono rivelare tumori quando il numero condizionale delle cellule tumorali raggiunge 10 9-10 10 e il livello minimo di un marker secreto da un tumore varia da uno a più femtomoli (tutte le cifre si basano su 1 ml di siero di sangue). L'elevata efficienza dell'uso di marcatori tumorali nella clinica può essere ottenuta mediante una combinazione di diversi test. Va notato che il numero di marcatori proposti per la diagnosi e il monitoraggio dei tumori maligni è in costante aumento e si verifica una fase di rivalutazione critica con l'obiettivo di formare una strategia e un uso adeguato.

4.4.1. INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI DEL TEST DEI MARCATORI DEI TUMORI

Determinare la concentrazione di marcatori tumorali in varie neoplasie richiede la conoscenza di fattori, sia in vivo che in vitro, che influenzano i risultati o li distorcono. Questo dovrebbe essere preso in considerazione non solo per i medici di laboratorio, ma anche per i medici che sono direttamente responsabili per il processo di osservazione e trattamento di un particolare paziente. I seguenti sono i principali fattori che influenzano la definizione dei marcatori tumorali.

• il grado di espressione e sintesi del marcatore;

• rilascio dei marcatori da parte delle cellule tumorali;

• farmaci e farmaci chemioterapici;

• escrezione dal corpo;

• intensità dell'afflusso di sangue al tumore;

• La posizione del corpo del paziente durante il prelievo di sangue;

• metodi di esame strumentali e non strumentali (per esempio, broncoscopia o biopsia);

• catabolismo del marcatore tumorale (ad esempio, stato funzionale del fegato e dei reni);

• cattive abitudini (fumare, bere alcolici). In vitro:

• condizioni di conservazione per i campioni;

• l'intervallo di tempo tra la raccolta del sangue e la centrifugazione (con la separazione del siero);

• grado di emolisi e ingiallimento;

• contatto di vasi sanguigni con la pelle;

• contaminazione del campione con saliva;

• influenza delle droghe;

• presenza di anticorpi alle immunoglobuline murine nel sangue dei pazienti (dopo immunoscintigrafia diagnostica e immunoterapia);

• errore metodologico nella determinazione dell'indice tumorale. È necessario tener conto che la maggior parte della circolazione

i marcatori del tumore del sangue non sono adatti per lo screening dei pazienti in assenza di sintomi, dal momento che ci sono una serie di limitazioni associate alla sensibilità e specificità diagnostica spesso bassa, nonché al limitato valore predittivo. Allo stesso tempo, ci sono un certo numero di casi riconosciuti quando è difficile da gestire senza la definizione di marcatori tumorali.

Questo è, in primo luogo, la valutazione dell'efficacia della terapia. Nelle prime fasi, i cambiamenti nella concentrazione del marcatore tumorale possono mostrare se la chemioterapia selezionata avrà successo o (nel caso di un aumento costante della concentrazione) la correzione della terapia è necessaria, fino alla cancellazione. Certamente, testare un marker tumorale è assolutamente inutile in casi di cancro gravi.

In secondo luogo, monitorare il decorso della malattia. L'uso di marcatori tumorali per monitorare il decorso di una neoplasia rende spesso possibile rilevare metastasi e / o recidiva del tumore per 3-5 mesi o più prima delle manifestazioni cliniche della malattia. In alcuni pazienti, il test dei marcatori tumorali dopo la rimozione chirurgica del sito tumorale primario può fornire un monitoraggio più sensibile rispetto all'endoscopia, all'ecografia o alla tomografia computerizzata. Il tasso di aumento del livello di tumore

un marker di solito ti consente di trarre una conclusione su un numero di osservazioni

0 la natura della progressione della malattia, in particolare, sulle metastasi. La conoscenza della natura dei cambiamenti nel livello del marker tumorale consente anche di ottimizzare il tempo del successivo esame dettagliato del paziente. Mantenendo un livello basso o normale dell'indicatore tumorale per un tempo sufficientemente lungo, un esame di follow-up, incluse tecniche invasive o costose, sembra ridondante. Al contrario, se il livello dei marcatori tumorali aumenta e sono necessarie informazioni sulla progressione della malattia al momento di decidere le tattiche di trattamento, tali studi vengono mostrati.

In terzo luogo, l'identificazione di tumori residui e ricorrenti. Un'inadeguata debole diminuzione del livello di un marcatore tumorale o l'assenza di una diminuzione indica generalmente una rimozione incompleta del tumore o la presenza di tumori multipli (metastasi). Informazioni di questo tipo possono avere un significato terapeutico e prognostico.

E infine, quarto, la previsione del decorso del processo tumorale. Si tratta di un moderno campo di applicazione dei marcatori tumorali estremamente intensamente in via di sviluppo, in particolare quelli la cui ricerca è correlata alla prognosi e, di conseguenza, influenza principalmente la scelta della terapia.

4.4.2. CANCRO DEL COLORE

Nei paesi europei, il cancro del colon-retto (CRC) si ammala

1 su 20 persone. Meno comunemente, questo tipo di cancro si trova in Africa e in alcune parti dell'Asia. Ora in Russia, il tasso di rilevamento del CRC aumenta in modo monotono.

Attualmente, l'uso di metodi molecolari nella diagnosi di CRC è considerato un'area di ricerca molto promettente ed importante, questo è dovuto al fatto che gli eventi che si verificano a livello di genoma dovrebbero essere considerati fondamentali nell'occorrenza e nella progressione di questi tumori. Ci sono una serie di fatti affidabili che indicano che il CRC nelle prime fasi di sviluppo può e deve essere identificato con metodi molecolari. I metodi di diagnosi molecolare della CRC consentono inoltre di prescrivere un trattamento adeguato e di predire il risultato in modo abbastanza accurato.

CRC si sviluppa in seguito a cambiamenti successivi (displasia / adenoma-adenocarcinoma), che sono basati su

violazioni. Tuttavia, i meccanismi responsabili dell'occorrenza e dell'accumulo di tali disturbi nella cellula epiteliale non sono completamente compresi. Un esempio delle difficoltà nel modo di studiare questo problema è il fatto che ci sono differenze nella frequenza di insorgenza di fasi benigne e maligne della malattia, in particolare nella sequenza displasia / adenoma-adenocarcinoma. È stato dimostrato che gli adenomi del colon-retto si verificano in più della metà della popolazione entro la 9 ° decade di vita e la CRC si sviluppa solo nel 5% della popolazione. Di conseguenza, solo alcuni dei cambiamenti precancerosi si trasformano in cancro.

Così, insieme alla vecchiaia e alle malattie infiammatorie croniche (colite ulcerosa, morbo di Crohn o coinvolgimento del colon con schistosomiasi), il CRC nei parenti di sangue è un fattore di rischio riconosciuto, se non il principale. Le cause che causano CRC in un membro della famiglia possono variare da rare sindromi autosomiche dominanti con un'alta incidenza di CRC (poliposi adenomatosa familiare, sindrome CRC ereditaria non poliposa) a condizioni meno geneticamente evidenti, come, per esempio, la rilevazione di adenoma nel più vicino parenti (genitore, fratello o figlio). È noto che il CRC è apparso in età più giovane, maggiore è il rischio statistico della sua insorgenza tra parenti stretti. Le sindromi ereditarie di CRC sono presentate in tabella. 4.6 secondo il fenotipo e le mutazioni nei rispettivi geni.

Va notato che lo studio dei meccanismi molecolari alla base di rare sindromi ereditarie ha contribuito alla comprensione della patogenesi della CRC sporadica, che è osservata molto più frequentemente nella popolazione, ma sulla base di eventi molecolari simili o simili.

Il ruolo dei disordini genetici molecolari nell'aspetto della CRC e, in particolare, dell'instabilità del genoma è stato studiato intensivamente in tempi relativamente recenti. Nel 1993, l'instabilità dei microsatelliti (MSI) è stata riscontrata in membri della famiglia con carcinoma del colon ereditario non colono (RTC). Questa scoperta servì da base per le ipotesi del fenotipo mutato del cancro, avanzato da Loeb, secondo cui una cellula deve sopravvivere a una varietà di mutazioni per diventare cancerosa. Ma per questo, dovrebbe inizialmente avere la capacità di mutare più spesso del normale, e questo a sua volta può

Tabella 4.6. Sindromi ereditarie CRC

Tabella 4.7. Tipi di disordini genetici e marcatori molecolari in CRC

essere associato all'inattivazione dei meccanismi responsabili della normale conservazione della struttura del DNA.

In quasi tutti i casi di RTK si nota sia l'instabilità cromosomica che l'instabilità MSI. In realtà, esiste una relazione inversa tra queste due violazioni. Pertanto, i tumori maligni con instabilità MSI sono solitamente diploidi e non presentano aberrazioni cromosomiche. I tumori con instabilità cromosomica sono caratterizzati da aneuploidia e sono spesso accompagnati dalla perdita o dall'aspetto di cromosomi aggiuntivi. L'individuazione così frequente dell'instabilità cromosomica o dell'instabilità MSI in questo caso non indica che questo sia un fenomeno molto comune e non specifico nel processo di insorgenza di qualsiasi tumore maligno, ma che l'instabilità del genoma è strettamente associata alla tumorogenesi.

Sia l'instabilità cromosomica che l'instabilità MSI possono essere rilevate nelle primissime fasi di RTK. Quindi, usando l'ibridazione comparativa del genoma per determinare il numero medio di errori durante la copia, siamo stati in grado di mostrare il loro aumento graduale con la progressione dell'adenoma con lieve displasia ad adenoma con grave displasia e successiva trasformazione in cancro (Tabella 4.8).

Tabella 4.8. Instabilità cromosomica in caso di RTK

I pazienti con una predisposizione ereditaria dovuta a disturbi del gene APC, compresi i disturbi della sequenza nucleotidica e l'espressione genica, sviluppano tumori, che di solito si sviluppano a causa dell'instabilità cromosomica, che è caratterizzata dalla perdita di alleli e disturbi citogenetici. I tumori in alcuni pazienti con CRC sporadico si verificano allo stesso modo.

Al contrario, nei pazienti con sindrome CRC ereditaria nepoliposa, le mutazioni nel gene che correggono gli errori del DNA provocano tumori caratterizzati da instabilità MSI e nucleotidi rilevati come ripetute sequenze nucleotidiche, alcune delle quali si trovano nei codoni dei geni. La perdita di alleli è raramente osservata. Questo tipo di patologia molecolare è anche osservato in circa il 15% dei casi di CRC sporadico ed è spesso associato a caratteristiche anatomiche, come la posizione nell'intestino prossimale (colon ascendente); bassa differenziazione delle cellule tumorali con componente muco, midollare o cricoide-cellulare; la presenza di un numero significativo di follicoli linfoidi con centri germinativi sulla periferia del tumore; infiltrazione linfocitaria del tumore.

La trascrizione inefficiente dei geni a seguito di una metilazione aberrante di sequenze di guanina citosante (isole C-G) in regioni di geni promotori è attualmente considerata come una delle componenti della patogenesi molecolare della terza sottospecie di CRC.

L'uso di metodi diagnostici molecolari nei pazienti ha un grande potenziale sia nella diagnosi precoce e nella valutazione della risposta del tumore alla terapia, sia nella prognosi della malattia. Come mostrato nella tabella. 4.9, con una tale diagnosi, è possibile utilizzare vari oggetti di studio.

In quei pazienti che hanno già CRC, i metodi molecolari possono essere utilizzati per identificare micrometastasi, per valutare più accuratamente lo stadio del processo tumorale, in particolare per rilevare micrometastasi nei linfonodi, o per valutare la possibile disseminazione ematogena di cellule tumorali nel midollo osseo.

Inoltre, la diagnostica molecolare ha un grande potenziale per rilevare le caratteristiche genotipiche e fenotipiche di un tumore, che determinano un'intera catena di eventi che portano a metastasi cellulari, il cosiddetto metastatico

Tabella 4.9. Uso di metodi di diagnostica molecolare per CRC

genotipo e fenotipo. Marcatori di questo tipo potrebbero indicare una maggiore probabilità di progressione del processo tumorale dopo un intervento chirurgico radicale.

Sono state identificate anormalità genetiche associate alla predizione o alla risposta alla chemioterapia per CRC, compresa la perdita di alleli a 18q, la scomparsa dell'espressione del gene DCC, le anormalità nel gene p53, la perdita di alleli sul braccio corto del cromosoma 1 e 5, mutazioni RAS. Gli studi sull'efficacia clinica dell'uso di tali marcatori molecolari sono stati formulati in modo convincente, sono attualmente condotti e includono un campione rappresentativo di popolazione. Per un uso diffuso nella pratica clinica, gli studi sui marcatori molecolari devono soddisfare tutti i requisiti per i test di laboratorio di routine, come riproducibilità, disponibilità e controllo di qualità adeguato. Infine, i risultati degli studi sui marcatori molecolari dovrebbero essere facilmente interpretati dai clinici e avere un valore terapeutico.

La complessità e il multistadio dei processi genetici e biochimici che si verificano nelle cellule tumorali, che consentono loro di metastatizzare, rendono difficile interpretare i valori di tali marcatori. Inoltre, i fattori non direttamente correlati al tumore, come la qualità della tecnica chirurgica, influenzano significativamente il risultato finale. Tra i geni marcatori tumorali che predicono una risposta terapeutica, l'attenzione è stata focalizzata su geni p53 e regolati dall'apoptosi regolati da p53.

Una delle aree dello studio genetico molecolare dei tumori è l'identificazione di disordini molecolari caratteristici del successivo sviluppo di tumori metacronici, a volte erroneamente considerati come una ricorrenza del tumore principale. Tali studi includono lo studio degli adenomi del colon-retto come bersaglio per identificare il gene marcatore a causa della loro alta frequenza nella popolazione come un cambiamento precanceroso rispetto alla bassa frequenza di rilevazione di tumori maligni. marcatore molecolare indicando un'alta probabilità di sviluppare adenomi metacroni, adenomi particolare, la capacità di trasformarsi in un tumore maligno, potrebbe essere utile per identificare gruppi di rischio per la successiva selezione colonscopia.

Al contrario, i pazienti nei quali gli adenomi metacronici non sono in grado di progredire possono essere esclusi dallo screening. La strategia di rimozione degli adenomi ha dimostrato che è associata a una diminuzione della frequenza di CRC e possono essere utili marcatori molecolari che identificano i pazienti con un rischio più elevato.

Anche lo studio delle feci e dei campioni di sangue ha un grande potenziale. Pertanto, l'uso di un test molto semplice per il sangue nascosto nelle feci ha ridotto la mortalità da CRC, ma la sua specificità rimane relativamente bassa. I test molecolari per l'individuazione nelle feci dei frammenti di DNA tumorale sono più progressivi. Numerosi studi hanno dimostrato che il DNA contenente mutazioni può essere identificato nelle feci e nel sangue dei pazienti con tumori con queste mutazioni. La diagnosi di tumori, lo screening e l'osservazione dinamica dei pazienti possono migliorare significativamente se si superano determinate difficoltà tecniche e i loro costi sono bilanciati.

Attualmente, i ricercatori stanno prestando grande attenzione allo studio delle prospettive per l'uso di marcatori genetici molecolari di CRC. Di seguito è riportata una breve descrizione dei marcatori tumorali che sono ora più spesso utilizzati nella pratica clinica.

Per la prima volta, un antigene embrionale-embrionale (CEA) fu scoperto nel 1965 da Gold and Freedman in uno studio sul tessuto gastrointestinale umano e sull'adenocarcinoma del colon. Più tardi CEA è stato rilevato nel siero di pazienti con CRC. Questi primi lavori sono stati molto incoraggianti. Poi è sembrato a molti quello trovato

test altamente specifico per la diagnosi di RTK. Tuttavia, in seguito, con il miglioramento dei metodi di rilevazione CEA e dell'accumulo di dati clinici, questo marcatore è stato anche in grado di essere isolato in altri tumori (tumori pancreatici, epatici, polmonari, tiroide e neuroblastoma), nonché in malattie non neoplastiche (cirrosi epatica, colite ulcerosa, pancreatite, bronchite cronica, enfisema, epatite virale, diverticolite, polipi, insufficienza renale). Pertanto, nel rilevamento del CEA è assolutamente esatto affermare che il paziente ha questo tipo di cancro. Allo stesso tempo, il CEA è ancora il marker di prima scelta per il CRC e viene utilizzato con un'elevata efficienza nel monitoraggio della malattia, ma l'attenzione principale è rivolta ai parametri quantitativi del metodo.

Nel 99% delle persone sane, il livello di CEA è inferiore a 5 ng / ml. Con CRC, la sensibilità del test varia dal 25 all'80% e dipende dalla dimensione e dal grado di differenziazione del tumore, nonché dall'estensione del processo. Il livello di CEA è correlato con lo stadio del processo tumorale. Quindi, secondo i dati riassuntivi di diversi autori, in accordo con le fasi secondo la classificazione di Dukes, un aumento della sua concentrazione era tipico per l'antigene: allo stadio A - 7,8 ng / ml, B - 30,3 ng / ml, C - 58,1 ng / ml, D - 134,3 ng / ml. Allo stesso tempo, la frequenza del rilevamento CEA (alla soglia del marker di 5 ng / ml) nei gruppi di pazienti con gli stadi indicati è aumentata e corrisponde a 3, 25, 45 e 65% e al valore del marker di soglia> 2,5 ng / ml è stata trovata anche più spesso con il suddetto Dukes-stages e corrisponde a 28, 45, 75 e 84%. Considerando che nello stadio A e B il marker tumorale è aumentato solo nel 3-28% dei pazienti, il suo utilizzo nella diagnosi precoce di CRC è problematico. I tumori altamente differenziati producono CEA più attivamente.

Secondo molti autori, il marker ha un valore predittivo, che consiste nel fatto che un elevato livello iniziale di CEA nel siero (oltre 25 ng / ml) indica un elevato rischio di recidiva precoce del cancro colorettale dopo la rimozione chirurgica del tumore.

Un esempio dell'uso del CEA è la determinazione della natura radicale dell'intervento chirurgico in CRC. Di norma, dopo la rimozione chirurgica radicale del tumore, entro la fine della sesta settimana, la concentrazione di antigene diventa inferiore alla norma. Se il livello del marcatore non cade dopo la rimozione del tumore primario,

pensare che il paziente abbia metastasi. Si raccomanda di determinare il CEA nei pazienti nel periodo postoperatorio dopo 3 mesi per 2 anni. Il monitoraggio regolare dei pazienti con CRC con l'inclusione del CEA migliora il tasso di sopravvivenza a 5 anni. La chemioterapia adiuvante (5-fluorouracile e levamisolo) in pazienti con CRC può causare un aumento transitorio del livello di CEA nel siero del sangue. Non è consigliabile determinare periodicamente il CEA nel monitoraggio della risposta alla terapia, tuttavia non ci sono test alternativi per valutare la risposta al trattamento nei pazienti con CRC.

Nella maggior parte dei pazienti, RTK (79,1%) rispetto al gruppo di controllo (10%) sono stati trovati anticorpi IgM e IgG al CEA, che permette anche di utilizzare questo indicatore come marcatore diagnostico e un fattore prognostico indipendente. Allo stesso tempo, la rilevazione di anticorpi anti CEA nel siero dei pazienti con CRC è associata ad una prognosi migliore e ad un aumento significativo del tasso di sopravvivenza a 2 anni.

L'analisi del livello di CEA nei lavaggi del colon prima dell'esame di routine endoscopica ha dimostrato che questo semplice test può essere utile nella medicina pratica per identificare gruppi di pazienti ad alto rischio di CRC.

L'uso del CEA per scopi diagnostici è limitato dalla sua bassa specificità, dovuta ad un aumento della concentrazione di antigeni sierici nelle malattie non neoplastiche, nonché all'effetto di alcuni fattori esogeni ed endogeni sulla sintesi di questo marcatore. Pertanto, quando si esaminano pazienti con tumori del colon, CA-19-9 viene utilizzato come marker della seconda scelta (vedi sotto). Questo è di particolare importanza in caso di neoplasie REA-negative.

Data la bassa sensibilità e specificità, non è consigliabile utilizzare la definizione di CEA nello screening CRC. Nel caso di un aumento di 5 volte del CEA nel siero e della presenza di disturbi clinici in un paziente, deve essere suggerito il CRC.

Un'analisi comparativa di tre marcatori tumorali (CA-19-9, CEA e α-fetoproteina) nel siero di pazienti con RTK in vari stadi del processo tumorale, in pazienti con colite ulcerosa cronica e in soggetti sani ha rivelato una differenza significativa tra pazienti con RTK localizzato e cronica colite ulcerosa in termini di CA-19-9 e CEA, nonché tra RTK localizzato e generalizzato per i due precedenti

marcatori tumorali. I valori dei marcatori tumorali nella colite ulcerosa cronica non hanno superato quelli normali. In un processo localizzato, il livello di CA-19-9 non supera 1000 unità / ml, CEA - 20 ng / ml. I parametri della α-fetoproteina nei pazienti con CRC rientrano nell'intervallo normale e aumentano, di regola, solo quando il processo tumorale è generalizzato, il che non consente l'utilizzo di questo marcatore nella diagnosi della malattia. Quando si utilizza REA CA-19-9 + complessa, la sensibilità diagnostica è del 91% e supera significativamente quella quando si utilizza un solo marker tumorale. Unire metodi diagnostici di dati strumento per identificare i marker tumorale (CA-19-9 e CEA) aumenta la frequenza di diagnosi del tumore del colon-retto localizzato del 14%, mentre il processo di generalizzazione - 9%.

Per i tumori caratterizzati da uno squilibrio tra i processi di proliferazione e apoptosi. L'endotelina-1, un polipeptide di 21 residui di aminoacidi, ha attività vasocostrittrice e mitogenica ed è anche coinvolta nei meccanismi di regolazione dell'apoptosi. L'esperimento ha dimostrato che l'endotelina-1 è un fattore di sopravvivenza ed è in grado di proteggere in vitro le cellule PTK dall'apoptosi indotta da FasL.

La frequenza di rilevamento e il livello di antigene Fas solubile (sFas) - un inibitore dell'apoptosi - nel siero dei pazienti con RTK è più alto che nelle persone praticamente sane. C'è stata una tendenza ad un aumento del contenuto di sFas nel siero in pazienti con RTK con metastasi nei linfonodi regionali e nel fegato, che rende possibile discutere il ruolo del sistema Fas / FasL come possibile bersaglio per la terapia antitumorale in pazienti con CRC.

È stato dimostrato che l'elevata attività della caspasi-3 è correlata ad un alto rischio di recidiva di RTK, specialmente nei casi della sua localizzazione destra. È stata anche rilevata una correlazione tra l'attività della caspasi-3 e le cellule CD57 + che filtrano il tumore.

Un ruolo importante nei meccanismi di regolazione dell'apoptosi nel PTK è giocato da bcl-2, che è normalmente espresso dalle cellule che rivestono il fondo delle cripte del colon. L'espressione di bcl-2 in B-stage RTK Dukes ha dimostrato di essere associata ad una migliore sopravvivenza dei pazienti e, di conseguenza, per i pazienti nei quali i tumori non esprimono bcl-2, è consigliabile effettuare una terapia adiuvante.

L'espressione di p53 immunoreattivo nel tumore primitivo in CRC è un marker ad alto rischio di recidiva dopo l'asportazione chirurgica della malattia e più spesso dopo il primo anno di osservazione. Allo stesso tempo, è stata rilevata una maggiore espressione di p53 in 47 e CEA nel 34,4% dei tumori. Si ritiene che nella valutazione della previsione CRC sia necessario definire entrambi i marcatori.

È noto che il danno genetico distingue i carcinomi primitivi del colon prossimale e distale. Pertanto, l'analisi multivariata dell'espressione di p53 nel CRC primario rivela più spesso l'aumentata espressione di p53 nel RTK distale (58,5%) che prossimale (41,7%). Allo stesso tempo, il periodo di recidive è inferiore nei tumori p53 + (75 e 38%, rispettivamente, p = 0,006). Un alto rischio di recidiva di CRC è stato notato tra i tumori p53 + con la loro localizzazione distale. Pertanto, la valutazione dell'espressione di p53 in CRC può servire come marker per la recidiva precoce della malattia ed è associata alla localizzazione del tumore nell'organo.

È stato dimostrato che il fallimento della chemioterapia in CRC è associato alla resistenza multiresistente di questi tumori. È stato dimostrato che l'espressione di varie isoforme di CD44 è associata al comportamento aggressivo del tumore e solleva la questione se il segnale di questo recettore modula la sensibilità al farmaco del tumore. È stato inoltre dimostrato che CD44 induce l'attivazione delle famiglie LYN e Akt src di tirosina chinasi. La capacità di sopprimere l'apoptosi può giocare un ruolo cruciale nello sviluppo dei tumori del colon, che è associato all'espressione di CD44.

Attivatori e inibitori del plasminogeno

Negli ultimi anni, lo studio delle metalloproteinasi della matrice extracellulare, strettamente correlate ai processi di invasione e metastasi dei tumori, ha attirato l'attenzione dei ricercatori. Con lo sviluppo di metastasi, ci dovrebbe essere una catena di eventi sequenziali che portano al rilascio di cellule tumorali dal loro ambiente originale e la formazione di noduli tumorali in organi e tessuti distanti. Si presume che per garantire i processi di invasione e metastasi, è necessaria una catena proteolitica complessa, comprese varie proteasi. Si ritiene che la plasmina, che riduce il livello delle glicoproteine ​​della matrice extracellulare e attivi alcune prometalloproteasi, svolga un ruolo cruciale nei processi di invasione e metastasi, mentre

in una catena di proteasi a più stadi, la proteasi serina è una posizione chiave - l'attivatore del plasminogeno del tipo urokinase (uPA), poiché catalizza la formazione di plasmina dal suo precursore del plasminogeno. Anche il recettore IRA (Pc-uPA) svolge un ruolo importante, poiché, quando l'uPA si lega al recettore, aumenta la sua capacità di attivare il plasminogeno. D'altra parte, gli inibitori di uPA - PAI-1 e PAI-2 possono essere presenti nei tessuti PTK. È stato dimostrato che i livelli di UPA e PAI-1 nel CRC sono più alti rispetto ai normali tessuti omologhi e ai tumori benigni.

La questione se l'uPA nell'RTK umano sia derivato dalle cellule tumorali stesse o dagli elementi dello stroma circostante (fibroblasti, macrofagi, leucociti) è rimasto a lungo senza risposta. Alla fine, Harvey et al. è stato possibile dimostrare che l'attivatore ha origine dalle cellule tumorali stesse e non viene preso in prestito dagli elementi della stroma e l'antigene viene rilevato più intensamente nelle regioni apicali e basali delle cellule PTK.

Lo studio più rappresentativo dei componenti del sistema di attivazione del plasminogeno nei campioni di CRC è stato condotto da Fujii et al. Hanno anche analizzato l'espressione dei geni UPA e PAI-1 usando il metodo PCR. Espressione UPA rilevata nel 58,8% dei tumori. Nei pazienti con uPA positiva e risultati negativi per PAI-1, la prognosi di sopravvivenza a 5 anni è stata significativamente peggiore. L'analisi multivariata ha mostrato che i risultati della determinazione simultanea di uPA e PAI-1 in CRC sono indicatori prognostici indipendenti.

La sopravvivenza dei pazienti dopo l'intervento chirurgico non era correlata con il contenuto di uPA nello stroma tumorale, tuttavia, è stato notato un pattern correlato al suo livello nell'epitelio tumorale, cioè determinare il livello di uPA potrebbe essere un test per diagnosticare RTK senza metastasi, così come il rischio di recidiva precoce dopo l'intervento chirurgico. È possibile che le proteasi possano essere prese di mira da farmaci che prevengono l'invasione e la metastasi della CRC.

Le metastasi epatiche sono un importante fattore che limita la prognosi nei pazienti con RTK. Esiste una correlazione tra iRA e metastasi epatiche. La trasduzione del gene tPA nelle cellule PTK può essere utile per contrastare le metastasi epatiche.

Il meno studiato in senso clinico, il componente del sistema di attivazione del plasminogeno è considerato come Rc-uPA, che è un glicopeptide tri-dominio legato alla membrana. questo

il recettore può anche esistere in una forma solubile (rRc-uPA) in estratti da un tumore, così come nel plasma sanguigno sia di persone sane che di pazienti oncologici. L'Rc-uPA solubile nel plasma è una molecola praticamente invariata, tuttavia, né l'esatto meccanismo del suo rilascio dalla superficie cellulare, né la sua funzione biologica, sono stati completamente studiati. Livelli elevati di rRs-uPA nel plasma sono stati rilevati in pazienti con RTK e la concentrazione di rRs-uPA è associata alla prognosi della malattia. È possibile che Pc-uPA possa dare un contributo significativo all'aumento dell'angiogenesi intorno al tumore, nonché alle metastasi microvascolari.

Pertanto, l'aumentata espressione di Rc-uPA, che caratterizza la capacità invasiva del tumore in vitro in almeno alcune sottopopolazioni di cellule RTK, è in parte il risultato dell'attivazione costante della cascata di segnalazione dipendente dalle protein chinasi attivate da mitogeni.

Recettori del fattore di crescita

Uno dei più importanti sistemi regolatori per la trasduzione del segnale mitogenico è la famiglia dei recettori tirosin-chinasi - prodotti del gruppo c-erbB di oncogeni, che comprende quattro recettori transmembrana con struttura simile - recettore del fattore di crescita epidermico (EPRF o ErbB1), nonché ErbB2 (HER2 / neu), ErbB3 (HER3) e ErbB4 (HER4). Oltre alla struttura, questi recettori differiscono per la specificità relativa e l'affinità per diversi ligandi comuni. Dopo l'attivazione come risultato del legame e della dimerizzazione del ligando, la tirosina chinasi del recettore interno viene attivata e acquisisce la capacità di fosforilare sia il recettore stesso che altre proteine ​​cellulari coinvolte nella trasmissione del segnale mitogenico.

Vari fattori di crescita sono coinvolti nella regolazione autocrina e paracrina della proliferazione delle cellule CRC. Negli ultimi anni, il significato clinico dei recettori del fattore di crescita e dei loro ligandi è stato attivamente studiato nel CRC, principalmente RESR, il recettore del fattore di crescita insulino-tipo 1 (RIGR-1), il recettore del fattore di crescita vascolare endoteliale (R-VEGF).

REFR è un prodotto oncogene c-erbB1, che è una tirosina chinasi transmembrana, il marker più studiato in termini clinici di questo gruppo in tumori di varia localizzazione, ma non sufficientemente studiato in CRC.

I recettori della famiglia ErbB possono formare sia omo- che eterodimeri, e in molti casi eterostrutture con la partecipazione del secondo rappresentante di questa famiglia, HER2 / neu, che non ha il suo ligando, sono i più attivi. Pertanto, HER2 / neu è un elemento chiave nella trasmissione di segnali mitogeni di fattori di crescita simili all'EGF e il suo blocco può rallentare o arrestare significativamente la crescita di tumori che dipendono da tali stimoli. Si ritiene che l'aumentata espressione di HER2 / neu nei tumori, incluso il CRC, possa servire da indicatore di sensibilità e obiettivo di una bioterapia più efficace di questi tumori. Gli studi clinici sono in corso e in letteratura sono presentati studi preliminari sull'espressione di HER2 / neu nella prognosi dei tumori del tratto gastrointestinale.

RIFR-1 e RIFR-2 sono potenziali mitogeni e forti stimolatori della crescita delle cellule tumorali. Gli effetti di promozione della crescita di entrambi i tipi di FGID sono mediati, principalmente da FGED-1. Non esiste un'unica opinione sul valore clinico di RIFR-1 in CRC fino ad ora.

La maggior parte degli studi ha mostrato una relazione inversa tra la scoperta di recettori ormonali steroidei (tipo endocrino di regolazione) e EGFR (auto e paracrina tipo di regolazione) nei tumori.

Il blocco di uno qualsiasi degli stadi della trasmissione del segnale mitogenico dei fattori di crescita può, in linea di principio, portare a una disregolazione della proliferazione delle cellule tumorali e potenzialmente all'inibizione della crescita del tumore. L'esperimento ha già studiato un numero sufficientemente ampio di farmaci che influenzano i suddetti processi: bloccanti specifici e non specifici del legame dell'EGFR ai ligandi, inibitori della tirosina chinasi e di altre chinasi, bloccanti del legame dei domini SH2 delle proteine ​​effettrici con un recettore attivato, composti che sopprimono l'attivazione del gene ras, compresi gli inibitori della farnesilazione. La maggior parte di essi sono allo stadio dello studio clinico, sebbene alcuni, in particolare, Herceptin, abbiano già superato studi clinici e si siano dimostrati piuttosto efficaci in alcuni tipi di tumori.

È noto che gli RTK sono tessuti bersaglio di ormoni steroidei e nel 25-60% dei casi mantengono la capacità funzionale del legame primario del meccanismo d'azione di uno o più steroidi, vale a dire i recettori degli estrogeni (RE, 40,9%), gli androgeni (RA; 15,5% ), progesterone (RP: 32,6%) e glucocorticoidi (WG: 59,1%).

Tuttavia, solo la presenza di ER e RP in un tumore può essere utilizzata come criterio per una prognosi favorevole alla sopravvivenza a 10 anni dei pazienti con CRC. Allo stesso tempo, i RE-EG sono più spesso rilevati nell'RTK nelle donne (60,5%) rispetto agli uomini (39,5%), con uno stadio localizzato della malattia (63,1%) e un tumore nel colon destro (59,4%).

Markers tumorali di angiogenesi

I ricercatori hanno mostrato grande interesse negli ultimi anni allo studio dei fattori angiogenici in un tumore e in particolare al VEGF. Vi è una crescente evidenza che le metastasi a diversi stadi del processo tumorale dipendono dal grado di vascolarizzazione del tumore.

Nelle metastasi ematogene, le cellule tumorali devono aderire alle cellule endoteliali, passare nel lume del vaso, sopravvivere nel sangue circolante, fermarsi in un organo o tessuto specifico e formare una colonia lì. Elevati tumori primitivi angiogenici, incluso CRC, con un'alta densità vascolare intratumorale possono produrre un clone angiogenico in un organo distante, che in condizioni favorevoli è in grado di formare metastasi. La maggior parte dei ricercatori ritiene che un alto grado di vascolarizzazione del tumore sia un marcatore statisticamente significativo per la presenza di metastasi nei linfonodi regionali. Nel 77% dei precedenti studi, è stata trovata un'associazione significativa tra l'angiogenesi tumorale e lo sviluppo di metastasi a distanza. E sebbene vi siano differenze significative nei gruppi di pazienti studiati e nei metodi usati per valutare l'angiogenesi, la maggior parte dei ricercatori ha dimostrato una relazione inversa tra la vascolarizzazione del tumore e la sopravvivenza dei pazienti con CRC. Inoltre, l'insufficiente vascolarizzazione e, di conseguenza, la sua ipossia aumentano l'espressione di geni associati alla resistenza (glicoproteina Pg, idrofolato reduttasi) alla chemioterapia e rappresentano un'importante inefficienza delle radiazioni neoadiuvanti e della chemioterapia.

Nella maggior parte dei pazienti (73,4%) con metastasi regionali nei linfonodi, il periodo di recidiva era significativamente più alto in assenza di espressione di VEGF e basso indice di SPF (frazione di fase S) nel tumore. Oltre al significato prognostico del VEGF, il blocco del recettore VEGF-2 ha dimostrato di inibire la crescita delle metastasi CRC nel fegato.

Attualmente, più di 200 composti hanno attività angiogenica e tutti possono essere suddivisi in due gruppi in base all'effetto inibitorio. Il primo gruppo comprende composti che influenzano il trasferimento di segnali angiogenetici da parte delle cellule endoteliali (antagonisti dei fattori di crescita endoteliale, inibitori della produzione di fattori angiogenici, migrazione delle cellule endoteliali) e il secondo - composti che influenzano la proliferazione delle cellule endoteliali. Tali farmaci antiangiogenici come gli inibitori di marimastat, batimastat - matrix metalloproteinase, SU 6661 sono i più promettenti.

Va notato che negli ultimi anni la nostra conoscenza dei processi biologici coinvolti nella formazione di nuovi microvasi nel tumore è aumentata in modo significativo. E sebbene i principi prognostici e terapeutici siano ancora in via di formazione, i progressi nella comprensione dei meccanismi patofisiologici della neoangiogenesi nei tumori sono già stati introdotti nella pratica clinica.

Il livello di timidilato sintetasi nel tumore è considerato uno dei marcatori più efficaci di resistenza ai farmaci e prognosi del CRC. L'enzima è necessario per la sintesi del DNA e catalizza la metilazione di deossiuridina monofosfato a deossitimidina monofosfato come cofattore per 5,10-metilenetetraidrofolato (5,10-CH2FH4). È noto che il 5-fluorouracile (5-FU), uno degli antimetaboliti più usati nel trattamento dei tumori gastrointestinali, quando somministrato a un paziente, forma 5-fluoro-2'-deossiuridina-5'-monofosfato che si lega in modo covalente alla timidilato sintasi, bloccando così Processo di sintesi del DNA nel tumore. Lo studio degli indicatori di espressione della timidilato sintetasi nei tumori di pazienti con CRC ha reso possibile considerarlo un fattore prognostico indipendente in questa categoria di pazienti. Allo stesso tempo, i tassi di sopravvivenza a 10 anni erano significativamente più bassi tra i pazienti nei quali era stata rilevata l'espressione tumorale dell'enzima.

Sulla base di un'analisi multivariata retrospettiva e di un alto grado di affidabilità dei risultati, per definizione, nell'espressione della timidilato sintasi nei tumori, questo marker può essere utilizzato in clinica come fattore di previsione indipendente per recidiva locale, metastasi a distanza, periodo di recidiva e sopravvivenza globale dei pazienti con RTK.

La prognosi migliore è stata per i pazienti con TRK con bassa espressione di timidilato sintetasi nel tumore primario. Allo stesso tempo, i ricercatori hanno dimostrato in modo convincente che nessun altro fattore prognostico, compresa l'età, il sesso, il grado di differenziazione del tumore, l'espressione di p53, può essere considerato un marker indipendente della prognosi, in particolare, la recidiva di questa malattia.

Il livello di espressione della timidilato sintetasi in caso di CRC generalizzato o ricorrente può essere un marker della sensibilità del tumore al 5-FU. Più spesso, i livelli di espressione più elevati dell'enzima sono stati trovati nelle metastasi addominali di CRC (82%) rispetto alle metastasi di un tumore nel fegato (47%). Si ritiene che questo dovrebbe essere preso in considerazione quando si predice la sensibilità delle forme disseminate di un tumore al 5-FU e modificando individualmente la strategia di chemioterapia nei pazienti.

È stato anche dimostrato che l'espressione di timidilato sintetasi e timidina fosforilasi nei tumori di pazienti con CRC non trattati non ha solo un valore prognostico nella scelta della chemioterapia 5-FU insieme a marcatori di proliferazione come p53 e Ki-67, ma è anche correlata con indicatori di sopravvivenza libera da malattia e globale. Allo stesso tempo, l'attività di questi due enzimi è stata studiata con un metodo biochimico in campioni tumorali appena congelati e la loro espressione è stata confrontata utilizzando un metodo immunoistochimico in sezioni di paraffina insieme a p53 e Ki-67. Una correlazione significativa è stata trovata anche tra l'indice dell'attività enzimatica della timidina fosforilasi e l'attività di legame del 5-fluoro-2'-deossisiridina-5'-monofosfato (metabolita 5-FU). È noto che l'attività della timidilato sintetasi e della timidina fosforilasi sono strettamente correlate ai processi di angiogenesi e proliferazione in CRC. Allo stesso tempo, l'espressione del VEGF era significativamente correlata all'attività della timidina fosforilasi e all'indice Ki-67 nel tumore, nonché alla durata di un periodo libero da recidive.

Quando si studia la diidropirimidina deidrogenasi, il primo enzima che metabolizza il 5-FU in 5-fluorodiidrouracile, è stato trovato che l'indice di espressione di questo enzima in un tumore può essere utilizzato come marker nella valutazione della sensibilità del CRC al 5-FU.

L'alta attività della sintetasi dell'ossido nitrico indotta può servire come marker di un flusso più aggressivo di CRC.

Si propone di utilizzare un metodo altamente sensibile e specifico per la determinazione dell'attività telomerasica nell'epitelio

Cellule CRC circolanti nel sangue L'attività enzimatica è stata rilevata nel 72% dei tumori negli stadi C e D (classification Dukes) CRC. Si ritiene che questo marker in questo metodo minimamente invasivo possa essere utilizzato nella diagnosi precoce, nella prognosi e nel monitoraggio dei pazienti con TCR.

L'aumento dell'espressione della fosfatasi CDC25B nelle cellule CRC nel 43% dei casi è stato trovato per indicare una prognosi sfavorevole della malattia. Pertanto, questi pazienti necessitano di terapia adiuvante. Si ritiene che CDC25B possa fungere da marcatore prognostico indipendente e persino fattori di controllo come le metastasi nei linfonodi regionali, il diametro del tumore primario, il grado di differenziazione e la profondità dell'invasione. Inoltre, il livello di espressione di CDC25B indica fortemente una possibile recidiva precoce degli stadi CRC B e C secondo Dukes.

Recentemente sono emersi studi che indicano la possibilità di utilizzare l'enzima per la sintesi di prostaglandine ed eicosanoidi - ciclossigenasi-2 (COX-2), noto anche come prostaglandina endoperoxide sintetasi - come marker per la diagnosi precoce e la prognosi di CRC. Dati sperimentali e clinici indicano il ruolo importante della COX-2 nella patogenesi della CRC. Viene evidenziata l'assenza di COX-2 nell'epitelio della normale espressione della mucosa e della proteina nel 40% dei polipi e nell'80-90% dei tumori maligni del colon, che conferma la partecipazione di COX-2 nei processi neoplastici e nella progressione del CRC. È stata stabilita una correlazione positiva tra l'espressione di COX-2 e la dimensione, stadio del tumore secondo la classificazione di Dukes. L'aumento dell'espressione di COX-2 in RTC è diventato la base per i tentativi di utilizzare i suoi inibitori, in particolare i farmaci anti-infiammatori non steroidei, come agenti profilattici che impediscono lo sviluppo di CRC e la malignità dei polipi del colon. Negli esperimenti su animali, è stato dimostrato che gli inibitori della COX-2 esercitano un effetto protettivo nella carcinogenesi del colon-retto. Inoltre, questi farmaci hanno impedito la formazione di nuovi polipi e contribuito alla regressione di quelli esistenti nel colon. D'altra parte, i dati di alcuni studi sperimentali suggeriscono che l'effetto antitumorale dei farmaci anti-infiammatori non steroidei è anche dovuto al fatto che essi inducono l'apoptosi nelle cellule PTK e inibiscono l'angiogenesi nei tumori sperimentali.

Altri marcatori CRC

In breve, ci concentreremo su alcuni marcatori tumorali, il cui uso sembra promettente per CRC.

Il livello di espressione di MUC1 nei tumori può essere utilizzato come marker nella valutazione della progressione e della prognosi di CRC.

L'inibitore dipendente dalla ciclina della chinasi P27 (KIP1) può essere utilizzato come marker per la rilevazione delle prime fasi del CRC. Tuttavia, non può essere utilizzato come marker per la progressione precoce di questi tumori.

Inoltre recentemente, è stato proposto di utilizzare un nuovo marker, TA90-IC, che è presente nel siero sotto forma di immunocomplessi circolanti, quando si stima la prevalenza di RTK. La base dello studio era il fatto che, secondo molti autori, il livello di CEA era aumentato solo nel 70% dei pazienti nella fase comune della malattia. Metastasi a distanza sono state rilevate nell'86% dei pazienti esaminati, sebbene molti di questi pazienti presentassero un tumore localizzato senza segni di generalizzazione del processo tumorale. L'analisi del livello dei marcatori precedenti ha mostrato che la concentrazione di TA90-IC era aumentata nell'82,9% e CEA - solo nel 70,2% dei pazienti. La combinazione di entrambi i marcatori ci ha permesso di stabilire la prevalenza del processo tumorale nel 93,5% dei casi. I ricercatori ritengono che questo lavoro dovrebbe essere continuato e il ruolo del TA90-IC nello screening e nel monitoraggio della progressione del CRC dovrebbe essere dimostrato.

Va notato che il più adeguato da un punto di vista clinico può essere la determinazione simultanea di un numero limitato di indicatori complementari che possono caratterizzare l'attività proliferativa del CRC, il suo potenziale metastatico, la sensibilità a vari tipi di regolazione centrale e locale. Il compito dei ricercatori che lavorano in questo campo è scegliere la combinazione ottimale quantitativamente e qualitativamente di marcatori molecolari nella diagnosi, nel monitoraggio e nella prognosi del CRC.

4.4.3. MALATTIE DEL CANCRO DEL PANCREZZO, DELLO STOMACO, DELL'ESOPAGO E DEL FEGATO

Nell'Europa occidentale, il cancro del pancreas è rilevato in circa 10 casi su 100000. Circa il 90% di tutti i tumori.

le patologie pancreatiche sono adenocarcinomi dei dotti e solo il 5% sono neoplasie neuroendocrine e carcinoma acinoso.

Il marker più utilizzato nella diagnosi del cancro del pancreas è CA 19-9. La specificità della sua determinazione varia dal 76 al 99% e la sensibilità dal 69 al 93%. Tuttavia, l'aumentata concentrazione di CA 19-9 nel siero non è specifica solo per gli adenocarcinomi pancreatici. Un alto livello di CA 19-9 è stato trovato in altre malattie del tratto gastrointestinale (pancreatite acuta e cronica, cirrosi epatica, infiammazione dei dotti biliari).

È stato dimostrato che solo il 55% dei pazienti con carcinoma pancreatico con diametro del tumore inferiore a 3 cm presenta un livello aumentato di CA 19-9 (> 37 U / ml). Di conseguenza, l'uso del marcatore CA 19-9 nella diagnosi del cancro del pancreas, in particolare le sue prime forme, è limitato, poiché il suo livello aumenta anche con i processi benigni sopra menzionati nel fegato e nel pancreas. Si consiglia di determinare gli indicatori CA 19-9 per stimare la prognosi del cancro del pancreas, ma non per la pratica di routine.

Negli studi prospettici, sono anche studiati una serie di altri marcatori per il cancro del pancreas: CA50, CA242, CA195, DU-PAN 2 mucine, CAM 17.1 / WGA. Tuttavia, al momento, CA 19-9 dovrebbe essere considerato il "gold standard" nella diagnosi del cancro del pancreas.

Il cancro allo stomaco è una delle forme più comuni di tumore al mondo. Nell'Europa occidentale, la sua frequenza è diminuita nell'ultimo decennio, mentre in Asia il tasso di mortalità è aumentato ed è di circa 100 ogni 100 mila. Negli Stati Uniti, 6 pazienti su 100000 muoiono di cancro allo stomaco.

Tre marcatori sono studiati in modo sufficientemente dettagliato per il cancro gastrico: CEA, CA 19-9 e CA 72-4, ma CA 72-4 è considerato il più sensibile e specifico. CEA e CA 19-9 hanno la stessa specificità, sebbene CA 19-9 possa essere più sensibile del CEA, tuttavia, nessuno dei marcatori sopra può essere usato nello screening e nella diagnosi precoce del cancro gastrico.

L'incidenza del cancro esofageo varia considerevolmente. Pertanto, in Asia centrale, l'incidenza di questi è di 50-100 casi per 100.000, mentre in Europa e negli Stati Uniti - 2-3 casi per 100.000. Nel 90% del carcinoma dell'esofago è rappresentato da carcinoma a cellule squamose e meno del 10% di adenocarcinoma.

Rispetto ad altri tumori gastrointestinali, i marcatori biochimici del cancro esofageo non sono stati studiati abbastanza. Tuttavia, si ritiene che SCC e citocheratine (CYFRA 21-1, TPA, TPS) dovrebbero essere considerati i migliori marcatori nella diagnosi di cancro dell'esofago dall'epitelio squamoso, mentre CA 19-9 è preferito nella diagnosi di adenocarcinomi esofagei. Tuttavia, i marcatori tumorali nella diagnosi dei tumori dell'esofago hanno ricevuto poca attenzione a causa della loro non specificità.

Un altro nome per questa malattia è "epatoma maligno". Tale diagnosi viene fatta nell'Europa occidentale con una frequenza di 5-10 casi ogni 100.000, e nell'Europa meridionale meno di 5 casi su 100.000. Il cancro del fegato è più spesso rilevato in Cina, dove è raccomandato uno screening endemico di questo tumore per individuare i tumori.

Il marcatore principale nella diagnosi di carcinoma epatocellulare è la α-fetoproteina, che, se analizzata, rivela tumori di piccole dimensioni, che contribuiscono a un aumento della sopravvivenza postoperatoria in questa categoria di pazienti. Tuttavia, va notato che il ruolo di α-FP nello screening per l'adenocarcinoma epatocellulare non è stato determinato da studi prospettici randomizzati. In considerazione del rilevamento molto raro di questi tumori nell'Europa occidentale, si ritiene che lo screening del carcinoma epatocellulare non sia necessario. Tuttavia, dal 1986, è stata raccomandata un'ecografia del fegato ogni 6 mesi e una determinazione ogni 3 mesi di concentrazione α-AF in pazienti positivi per l'antigene di superficie dell'epatite B, così come quelli che soffrono di epatite cronica attiva o cirrosi epatica. Si ritiene inoltre che i pazienti con infezione persistente, in particolare i pazienti con epatite C virale, dovrebbero anche essere considerati a rischio di adenocarcinoma epatocellulare. È dimostrato che il rischio di sviluppare questo tumore nell'epatite C virale e nella cirrosi epatica è 100 volte superiore a quello delle persone non infette.

Uno dei problemi importanti con l'uso di α-FP nella diagnosi differenziale di adenocarcinoma epatocellulare è l'epatite e la cirrosi epatica, in cui aumenta anche il livello del marcatore tumorale. Pertanto, la separazione di α-OP fucosilato dal normale α-OP legandosi alle lectine aiuta nella diagnosi differenziale delle suddette malattie. Identificare queste frazioni α-OP aiuta nella diagnosi differenziale del carcinoma epatocellulare. Inoltre, con malattie benigne, il livello di α-FP può aumentare temporaneamente, mentre con il carcinoma epatocellulare, è costantemente elevato nel siero del sangue. Pertanto, la determinazione di α-OP più volte nell'arco di 2-3 settimane consente di escludere i suoi valori di falsi positivi. Inoltre, recentemente è apparso un nuovo marcatore nella diagnosi di adenocarcinoma epatocellulare - des-gamma-carboy protrombina (DCP), noto anche come PIVKA II (una proteina indotta da una carenza di vitamina K). La combinazione di questo marker con α-FP consente di identificare il carcinoma epatocellulare nell'86% e un tumore solitario nel 78,3%, e in questi casi uno di questi marker sarà positivo.

4.4.4. NON FORMAZIONI DEL SISTEMA RIPRODUTTIVO FEMMINILE

Le neoplasie genitali nelle donne rappresentano il 15% di tutti i tumori, e sono distribuite in base al loro tasso di decadimento nel seguente ordine: cancro del corpo dell'utero, delle ovaie e della cervice. Tuttavia, nella struttura della mortalità, il tumore ovarico è al primo posto, seguito dal cancro cervicale e uterino. Ad esempio, negli Stati Uniti, 20 mila nuovi casi di cancro ovarico e 12 mila morti da questo tumore sono registrati ogni anno. L'eziologia della malattia è sconosciuta, tuttavia l'anovulazione, l'uso di alcuni contraccettivi e la suscettibilità familiare sono considerati fattori di rischio.

Più del 90% dei tumori ovarici sono di natura epiteliale, vale a dire nascono dall'epitelio celomatico. I tumori ovarici epiteliali sono classificati in base al tipo di cellula: sierosa, mucinosa, endometrioide, a cellule chiare, epiteliale mista, indifferenziata, squamosa. Molto spesso, il cancro ovarico si sviluppa da cellule sierose.

Il miglior marcatore per il carcinoma ovarico epiteliale è la mucina - CA 125. Durante le mestruazioni, il livello del marcatore nelle donne può aumentare fino a 100 kU / le più alto. Il livello di CA 125 aumenta in quasi l'80% dei pazienti con tumori ovarici epiteliali, tuttavia, solo la metà dei pazienti con carcinoma ovarico di stadio I secondo la classificazione internazionale (FIGO) di questa malattia mostra alti tassi di marcatori tumorali. La sensibilità insufficiente nella diagnosi precoce e il riscontro di valori elevati di CA 125 in vari tumori benigni e altri adenocarcinomi, non consentono l'uso di questo indicatore come marker per la diagnosi precoce del carcinoma ovarico. Insieme al livello di altri marcatori (α-OP, hCG, hCGb), il livello di CA 125 può aumentare con i tumori delle cellule germinali.

La prognosi del cancro ovarico dipende principalmente dallo stadio della malattia. Lo screening di CA 125 è insensibile e solo il 50% dei pazienti con stadio I della malattia ha un livello elevato di marker, motivo per cui questo marker non è raccomandato per la rilevazione di casi sporadici della malattia. Tuttavia, la determinazione del CA 125 in combinazione con l'esame rettovaginale manuale degli organi pelvici e l'ecografia transvaginale può essere importante nella diagnosi precoce del carcinoma ovarico.

Uno studio multicentrico prospettico sulle donne in postmenopausa con tumori nella pelvi e un confronto tra ecografia transvaginale, esame manuale degli organi pelvici e determinazione di CA 125 (soglia CA 35 35 kU / l) ha mostrato che la diagnosi era confermata con questi metodi rispettivamente al 77, al 76 e al 74%. Inoltre, utilizzando l'analisi di regressione, è stato dimostrato che, rispetto all'ecografia, la CA 125 è più sensibile, ma il valore diagnostico è inferiore a quello di uno studio manuale. I tumori non vengono rilevati con una combinazione dei risultati negativi dei tre metodi. Determinare il livello di CA 125 prima dell'intervento chirurgico può richiedere al medico una possibile quantità di benefici chirurgici.

È noto che i fattori prognostici tradizionali nei pazienti con carcinoma ovarico sono lo stadio della malattia, il grado di differenziazione e il tipo istologico del tumore, la dimensione del tumore residuo dopo la chirurgia citoriduttiva palliativa. Allo stesso tempo, gli studi multicentrici hanno dimostrato che il livello di CA 125 nel siero dei pazienti dopo il 1 °, 2 ° e 3 ° ciclo di chemioterapia è uno dei più importanti fattori prognostici precoci

lui una ricaduta della malattia. Un'emivita prolungata della CA di 125 o meno di una riduzione di 7 volte nei livelli dei marcatori tumorali nei primi mesi dopo il trattamento indica un risultato scarso. Ulteriori studi hanno dimostrato che la concentrazione di CA 125> 70 kU / l prima del terzo ciclo di chemioterapia è il fattore più importante nel predire la progressione della malattia nei prossimi 12 mesi.

CA 125 durante il monitoraggio dei pazienti con carcinoma ovarico consente di rilevare una recidiva precoce. Tuttavia, non ci sono dati in letteratura che indicano che l'individuazione tempestiva della recidiva della malattia possa migliorare i tassi di sopravvivenza. Un aumento di CA 125 indica una malattia residua nel 94,8% dei casi, tuttavia, quasi la metà dei pazienti con valori di marker normali ha avuto anche una malattia (nodi tumorali) secondo la "seconda oculistica" - laparotomia. I livelli di CA 125 sono aumentati nel siero del 25% dei pazienti che hanno solo segni microscopici della malattia e nel 79% dei pazienti il ​​cui diametro di un tumore ricorrente è superiore a 1 cm durante laparotomia.

Cancro al seno

Il cancro al seno (BC) è una delle principali cause di morte per le donne nei paesi dell'Europa occidentale, e durante la vita di una donna, il rischio di questo tumore è del 12,2% e il rischio di morire è del 3,6%. Ci sono molti fattori associati al rischio di cancro al seno: fattori genetici e familiari, fattori ormonali (menarca precoce, menopausa tardiva, tarda prima gravidanza), dieta, malattie benigne della mammella (principalmente associate a iperplasia atipica).

Attualmente, un certo numero di marcatori tumorali sono noti per il cancro al seno: MIS-1 (CA 15-3), CEA, oncoproteine, citocheratine. I più usati sono CEA e CA 15-3. Ci sono anche altri membri della famiglia di geni MIS-1: MSA, CA 519, BR27-29, BRMA. Hanno tutti la stessa sensibilità e specificità, così come la SA 15-3. Pertanto, l'uso di diversi marcatori non aggiunge immediatamente alle informazioni ottenute utilizzando CA 15-3. Un certo numero di marcatori, come le citocheratine (TPA, TPS, CYFRA 21-1) e le oncoproteine ​​solubili (c-erbB-2), sono attualmente oggetto di uno studio approfondito e sono sottoposti a valutazione clinica.

La sensibilità dei marcatori tumorali nei pazienti con carcinoma mammario in fase iniziale è molto bassa (15-35%), quindi il loro uso nella diagnosi

spesso difficile. Ovviamente, i valori dei marcatori bassi risultanti non escludono la presenza di focolai primari e metastatici. D'altra parte, alti livelli del marcatore nei pazienti con cancro al seno indicano quasi completamente la presenza di generalizzazione del tumore e metastasi individuali.

Alti livelli di CEA, CA 15-3 e altri marcatori della famiglia MIS-1 sono chiaramente associati allo stadio del cancro al seno, alle dimensioni del tumore e al coinvolgimento dei linfonodi regionali nel processo tumorale. Ma non è ancora chiaro se questi marcatori siano fattori prognostici indipendenti. Inoltre, non è noto se l'uso di tale marker tumorale come indicatore di recidiva precoce della malattia porterà ad un aumento della sopravvivenza libera da recidiva e globale dei pazienti.

Nel caso di trattamento radicale del carcinoma mammario, nella diagnosi precoce di recidiva possono anche essere indicate le determinazioni seriali di CEA e CA 15-3. Questi marcatori tumorali entro 2-18 mesi (in media 5,2 mesi) si riscontrano nel 40-60% dei pazienti con carcinoma mammario recidivante prima di una risposta positiva in base ai risultati di metodi clinici, strumentali e radiologici (radiografia del torace, ecografia epatica, scansione scheletrica). La determinazione dinamica dei livelli CEA e CA 15-3 è considerata un test piuttosto sensibile nella diagnosi precoce delle metastasi ossee e del fegato e, inoltre, riduce la frequenza dei pazienti con entrambe le procedure diagnostiche di scansione isotopica e radioisotopica.

Marcatori tissutali nel carcinoma mammario

In contrasto con i classici marcatori tumorali, determinati nel siero, i marcatori cellulari o tissutali sono digitati direttamente nel tessuto tumorale. La maggior parte di essi caratterizza alcune caratteristiche biologiche di un tumore, le caratteristiche specifiche del suo comportamento e della sua regolazione, ad esempio la sensibilità ormonale o la tendenza all'invasione e alla metastasi. Per alcuni marcatori molecolari, una funzione biologica specifica non è stata ancora stabilita. Il significato principale di tali marcatori risiede nel fatto che essi caratterizzano le caratteristiche biologiche di ciascun tumore specifico e aiutano con la predizione e l'individuazione del trattamento farmacologico della malattia.

Nella tab. 4.10 presenta indicatori biologicamente significativi che sono marcatori tissutali attivi o potenziali del carcinoma mammario.

Tabella 4.10. I principali gruppi di marcatori prognostici tessuto / cellulare per il cancro al seno

Nel caso generale, la definizione di un marcatore molecolare nel carcinoma mammario può avere tre risultati pratici: 1) identificare tra i pazienti con stadi precoci di gruppi a rischio di cancro che richiedono un trattamento aggiuntivo, così come quelli non soggetti a terapia adiuvante; 2) determinazione della sensibilità a determinati tipi di terapia e individualizzazione degli schemi di trattamento adiuvante di pazienti con un processo comune; 3) lo sviluppo di nuovi farmaci.

I recettori degli ormoni steroidei, principalmente i recettori degli estrogeni (ER), sono stati tra i primi indicatori inclusi nella pratica del trattamento degli indicatori del cancro al seno correlati alla categoria dei marcatori cellulari. Un po 'più tardi, in aggiunta a loro, sono stati identificati anche i recettori del recettore del progesterone (RP).

La presenza di ER nel tumore primitivo del seno indica la sua potenziale sensibilità a misure terapeutiche volte a rimuovere la fonte di estrogeni dal corpo oa neutralizzarne gli effetti (ovariectomia, uso di antiestrogeni).

L'RP è interessante come marker molecolare del cancro al seno, non solo perché è il primo elemento della risposta della cellula ai progestinici, determinando la sensibilità ai farmaci corrispondenti, ma anche perché la sua sintesi nelle cellule del cancro al seno è indotta dagli estrogeni. Pertanto, la presenza di RP può indicare l'attività funzionale di ER.

Attualmente, varie cliniche e laboratori utilizzano tre metodi relativamente equivalenti per determinare lo stato del recettore del cancro al seno: radioligando - valutazione della capacità di legame del recettore nel citosol dei tumori; saggio immunoenzimatico - determinazione della concentrazione della proteina del recettore immunoreattivo negli stessi citosol; colorazione immunoistochimica - specifica delle sezioni tumorali che utilizzano anticorpi contro le proteine ​​recettrici. Il vantaggio dei primi due metodi è quantitativo, consentendo di oggettivare i criteri per la valutazione dello stato del recettore. Il metodo radiolegando consente inoltre di valutare l'attività funzionale del recettore in uno dei primi stadi della sua interazione con l'ormone, il che rende la predizione della sensibilità ormonale più affidabile rispetto alla determinazione delle proteine ​​immunoreattive.

D'altra parte, sebbene il metodo immunoistochimico sia di natura semi-quantitativa, ha un valore importante, cioè che quando si colorano le sezioni si può chiaramente

determinare l'appartenenza dei recettori alle cellule tumorali. Quando si utilizzano metodi biochimici questa possibilità è assente. Inoltre, questo metodo consente di lavorare con materiale d'archivio - blocchi di paraffina e persino bicchieri già pronti, il che lo rende l'unica opzione possibile quando è sorta la necessità di una ricerca sui recettori degli ormoni steroidei o è stata realizzata molto tempo dopo l'operazione.

È noto che la variante ormone-dipendente del carcinoma mammario, quando viene digitato sia uno o almeno uno dei recettori degli ormoni steroidei, è caratterizzata da un decorso favorevole, e il periodo postoperatorio in questi pazienti è migliore rispetto a quello dei tumori recettori negativi. Tuttavia, nel lavoro clinico pratico, i risultati della determinazione dei recettori degli ormoni steroidei sono utilizzati principalmente nella selezione di pazienti sensibili alla terapia endocrina.

Recettori del fattore di crescita. Questo gruppo comprende anche fattori di crescita stessi - proteine ​​e piccoli polipeptidi prodotti dalle stesse cellule tumorali e altri componenti del tessuto tumorale (fibroblasti, macrofagi e linfociti infiltranti il ​​tumore, cellule endoteliali) e stimolando la crescita di cellule di produzione (meccanismo autocrino) o cellule vicine (paracrina meccanismo).

Vari fattori di crescita sono coinvolti nella regolazione autocrina e paracrina della proliferazione delle cellule del cancro al seno: peptidi del gruppo EGF (fattore di crescita trasformante α, anfiregulina, ecc.) Che interagiscono con il recettore comune, fattori di crescita insulino-simili (IGF), somatostatina, ecc. I recettori per questi fattori di crescita erano trovato in tumori in pazienti con carcinoma mammario. La presenza nel tumore della ghiandola mammaria dell'EGFR, specialmente in assenza di recettori ormonali steroidei, indica una prognosi sfavorevole della malattia anche nelle fasi iniziali e la resistenza alla terapia endocrina. Vi sono prove che la presenza di recettori e recettori della somatostatina IGF indica una prognosi più favorevole del cancro al seno.

Tuttavia, a causa dell'ambiguità dei risultati ottenuti da diversi autori, nessuno degli indicatori che caratterizzano la sensibilità del cancro al seno ai regolatori auto e paracrini è entrato nella pratica clinica di routine, come lo studio del livello dei recettori degli ormoni steroidei. Ci si può aspettare, tuttavia, che nel prossimo futuro l'interesse per lo studio dell'EGFR nel carcinoma mammario aumenterà nuovamente, a causa del fatto che già nella fase clinica

prove, farmaci che agiscono specificamente sull'EGFR, anticorpi monoclonali al recettore e inibitori della tirosina chinasi interna EGFR, che implementano il primo stadio della trasmissione del segnale mitogenico, sono stati rilasciati.

Va notato che finora il "gold standard" nello studio della diffrazione dei raggi X è considerato come la determinazione del radioligando nella frazione di membrana dei tessuti usando EGF 125 I-labeled e la successiva separazione dell'idrossil-apatite.

Un certo successo nel campo dell'uso pratico dei marcatori associati alla regolazione REFR-dipendente della crescita del cancro al seno è già stato raggiunto dopo la comparsa del farmaco Herceptin, che è un anticorpo umanizzato di HER2 / neu, uno dei recettori della famiglia ErbB, a cui appartiene REFR.

La famiglia del recettore della tirosina chinasi - prodotti del gruppo c-erbB di oncogeni, che comprende quattro recettori transmembrana con struttura simile, REFR (ErbB-1), ErbB-2 (HER2 / neu), ErbB-3 (HER3) ed ErbB-4 (HER4) ) è uno dei sistemi normativi più importanti per la trasmissione del segnale mitogenico.

Oltre alla struttura, la famiglia di recettori ErbB si differenzia per la specificità relativa e l'affinità per diversi ligandi comuni. La caratteristica principale di tutte le tirosin chinasi del recettore è la localizzazione transmembrana e la necessità di interagire con il corrispondente ligando (fattore attivante) per la realizzazione dell'attività della chinasi e dei successivi effetti biologici. Dopo l'attivazione come risultato del legame e della dimerizzazione del ligando, la tirosina chinasi del recettore interno viene attivata e acquisisce la capacità di fosforilare sia il recettore stesso che altre proteine ​​cellulari coinvolte nella trasmissione del segnale mitogenico. I recettori della famiglia ErbB possono formare sia omo- che eterodimeri, e in molti casi le eterostrutture con la partecipazione del recettore HER2 / neu, che non ha il suo ligando, sono i più attivi.

Pertanto, HER2 / neu è un rappresentante unico della famiglia considerata delle tirosine chinasi transmembrana, poiché, senza avere il proprio ligando e non interagendo con nessuno dei noti fattori di crescita che attivano i recettori correlati, è comunque un elemento chiave nella trasmissione dei segnali mitogenici di tutti gli EGF- peptidi simili ed è necessario per il buon funzionamento dell'intero sistema.

Per quanto riguarda il valore prognostico della sovraespressione o amplificazione del gene c-erbB-2, nonostante il materiale gigantesco (più di 12.000 pazienti con carcinoma mammario sono stati esaminati in vari laboratori in tutto il mondo), non c'è consenso sul valore predittivo di HER2 / neu. Alcuni autori hanno notato il suo effetto avverso sulla sopravvivenza libera da recidiva di pazienti con carcinoma mammario senza metastasi nei linfonodi, altri ricercatori non trovano una relazione affidabile tra questi indicatori. I dati pubblicati indicano che i tumori con un gene HER2 / neu amplificato non rispondono bene alla terapia ormonale, ma sono sensibili alla successiva chemioterapia. Attualmente, si ritiene inoltre che i pazienti con tumori HER2 / neu-positivi debbano essere raccomandati a regimi di chemioterapia più intensivi rispetto ai pazienti con tumori che non hanno aumentato l'espressione di questo oncogene.

Sistema di attivazione del plasminogeno. La capacità di metastatizzare e di invadere è una delle proprietà fondamentali dei tumori maligni, il cui meccanismo più importante è la distruzione della membrana basale e della matrice extracellulare circostante da proteasi associate al tumore. Queste proteasi sono anche coinvolte nella neoangiogenesi, contribuendo alla proliferazione di nuovi vasi sanguigni nel tumore.

La cascata proteolitica dell'attivazione della plasmina nel tessuto tumorale occupa un posto centrale. Si ritiene che la plasmina, che è in grado di ridurre il livello delle glicoproteine ​​della matrice extracellulare e di attivare alcune proteasi prometali, come la collagenasi di tipo IV, gioca un ruolo cruciale sia nella diffusione locale del tumore che nella formazione di metastasi in organi e tessuti distanti. In una catena a più stadi di proteasi che porta alla distruzione della matrice extracellulare, l'attivatore del plasminogeno del tipo urochinasi (uPA) occupa una posizione chiave. Anche il recettore uPA situato sulla superficie cellulare svolge un ruolo importante, poiché la capacità di uPA di attivare il plasminogeno aumenta quando si lega ad esso. In generale, il processo di formazione della plasmina è un'amplificazione ciclica regolata da un meccanismo di feedback.

Oltre a uPA, un attivatore del tipo di tessuto (tPA) è anche coinvolto nell'attivazione del plasminogeno, ma il suo ruolo nello sviluppo dei tumori sembra essere opposto e si riduce alla distruzione delle cellule tumorali.

cellule e la protezione dei tessuti circostanti. L'attività di IRA e tPA è inibita da due inibitori proteici appartenenti alla famiglia dei Serpin, PAI-1 e PAI-2. Sulla base di dati sperimentali e clinici, durante la crescita del tumore, anche due inibitori degli attivatori del plasminogeno svolgono un ruolo diverso: il PAI-1 protegge le cellule tumorali dall'autodistruzione e il PAI-2 inibisce i processi proteolitici nella matrice extracellulare.

I vari componenti del sistema di attivazione del plasminogeno nel tessuto mammario possono essere localizzati sia sulle cellule tumorali stesse che sui fibroblasti dello stroma, linfociti e macrofagi e cellule endoteliali che si infiltrano nel tumore. A questo proposito, possiamo supporre che il processo di attivazione del plasminogeno sia principalmente paracrino.

Il livello e il rapporto di espressione dei componenti del sistema di attivazione del plasminogeno nel tessuto tumorale può servire da indicatore dell'attività tumorale metastatica e invasiva, a seguito del quale un fattore prognostico biologicamente significativo per tumori maligni o un indicatore del rischio di neoplasie benigne. Inoltre, la soppressione dell'attivazione del plasminogeno da parte dell'urochinasi a vari livelli può diventare uno degli approcci allo sviluppo di nuovi tipi di terapia antimetastatica, per i quali è necessario un uso clinico per identificare gruppi di pazienti potenzialmente sensibili a tale trattamento. Lo sviluppo di tali farmaci è già abbastanza attivamente portato avanti nei laboratori sperimentali e nelle aziende farmaceutiche, il che rende particolarmente rilevante lo studio delle loro proteine ​​bersaglio nei tumori umani.

Il metodo più adeguato per valutare il livello di espressione dei componenti del sistema di attivazione del plasminogeno è attualmente considerato il dosaggio immunoenzimatico quantitativo per determinare la loro concentrazione nei citosol dei tessuti. Sfortunatamente, non sono ancora state stabilite soglie uniformi, sebbene la ricerca cooperativa internazionale sia già stata condotta in questa direzione.

Fattore di crescita endoteliale vascolare. Negli ultimi anni, molta attenzione è stata posta al problema della neoangiogenesi - la formazione di nuovi vasi sanguigni - nei tumori maligni. A differenza della vasculogenesi, l'angiogenesi è il processo di diramazione dei nuovi processi capillari dai vasi sanguigni esistenti. Il fatto che un tumore non possa svilupparsi e crescere senza la formazione di

ha una vasta rete di capillari che forniscono alle cellule ossigeno e sostanze nutritive. Lo studio dei meccanismi molecolari dell'angiogenesi ha permesso di passare da una valutazione microscopica della densità dei vasi sanguigni nel tessuto tumorale allo studio di specifiche molecole coinvolte nella regolazione della formazione e della crescita di nuovi vasi sanguigni. Il più importante regolatore positivo dell'angiogenesi è indubbiamente il VEGF, detto anche fattore di permeabilità vascolare. L'unicità di questo fattore sta nel fatto che, a differenza di tutti gli altri fattori di crescita, è mitogenico solo in relazione alle cellule endoteliali. Dimostrato che il VEGF svolge un ruolo chiave nella neoangiogenesi nel cancro al seno.

I risultati di numerosi studi clinici retrospettivi pubblicati di recente mostrano che l'espressione di VEGF nel carcinoma mammario sembra essere essenziale per la prognosi della malattia e influenza anche la sensibilità dei tumori al trattamento ormonale e farmacologico. L'alto livello di ero indica una prognosi sfavorevole sia per il carcinoma mammario precoce che per quello comune. Inoltre, nuovi farmaci con proprietà anti-angiogeniche vengono attivamente sviluppati e studiati, e la valutazione dell'attività dell'angiogenesi da VEGF può essere la base per il loro uso mirato.

Cervical Cancer

Quasi in tutto il mondo, il cancro cervicale dopo il tumore al seno è la seconda causa di morte per malattie tumorali. I principali fattori di rischio per questa malattia sono socio-economici, matrimoni precoci, un gran numero di partner sessuali, nonché infezioni causate dal papillomavirus umano (HPV) (tipi 16, 18, 31 e 45). Gli indicatori di sopravvivenza a 5 anni per questa malattia sono circa il 70%. Tuttavia, se una neoplasia viene rilevata in una fase precoce, il tasso di sopravvivenza a 5 anni aumenta al 90%. Va notato che il 90% dei tumori del collo dell'utero è un carcinoma a cellule squamose e di altri tipi istologici è l'adenocarcinoma e il carcinoma a cellule squamose. Sarcomi o cancro neuroendocrino sono molto raramente trovati.

Nella diagnosi del carcinoma a cellule squamose del collo dell'utero viene utilizzato come antigene del marcatore tumorale SCCA - una proteina (peso molecolare 48 kD) con una forte omologia della famiglia degli inibitori della proteasi, le cosiddette serpi. La sensibilità del metodo allo stadio I della malattia è inferiore al 30% e allo stadio IV - 90%. tuttavia

L'espressione di SCCA può anche aumentare in altri tumori a cellule squamose (carcinoma polmonare, tumori della testa e del collo, tumori esofagei e vaginali), tumori benigni della pelle (psoriasi, eczema), polmoni (sarcoidosi), fegato e reni. Questo marcatore tumorale non è usato nello screening.

Per lo screening del cancro cervicale, il programma Papanicolau, i metodi diagnostici strumentali e morfologici che diagnosticano tumori preinvasivi, come il carcinoma in situ (CIS) e la neoplasia intraepiteliale della cervice (CIN), sono stati proposti in tutto il mondo. Lo sviluppo di questi processi entro 10-15 anni può precedere il cancro cervicale. Nella diagnosi delle prime fasi, SCCA non viene utilizzato, poiché il livello del marcatore tumorale dipende dal volume del tumore primario, dallo stadio e dal coinvolgimento dei linfonodi nel processo tumorale. Livelli elevati di SSCA prima del trattamento possono essere un fattore indipendente nella valutazione della lesione metastatica dei linfonodi regionali.

Valori elevati del marker prima del trattamento indicano una prognosi sfavorevole nei pazienti con carcinoma a cellule squamose della cervice. Alcuni studi hanno dimostrato che SCCA può essere utilizzato come fattore prognostico indipendente nel cancro cervicale. Negli adenocarcinomi cervicali, CA 125 è più utile come fattore prognostico, ma non SCCA.

Il marcatore SCCA è determinato per rilevare la recidiva precoce del carcinoma a cellule squamose del collo dell'utero, così come il monitoraggio prima della terapia neoadiuvante e prima di una terapia recidiva del tumore. In questi casi, la correlazione è dell'80%, che è di importanza clinica significativa nella selezione dei pazienti per la successiva radioterapia o trattamento chirurgico.

Il tumore endometriale rappresenta il 50% di tutti i tumori maligni del tratto urogenitale nelle donne e nell'80% dei casi si riscontra durante l'esame dell'utero. La sopravvivenza allo stadio I è 80%, a IV - il 10%. Nel 60-80% dei casi, i tumori presentano una struttura adenocarcinoma.

Molto spesso, il cancro dell'endometrio aumenta il marker tumorale CA 125: nella fase della malattia fino al 22% e allo stadio III-IV - fino all'80%, il livello del marker è superiore a 35 kU / l. Non esiste un marcatore tumorale per lo screening per la diagnosi precoce del carcinoma endometriale. La ricerca morfologica è considerata un metodo tradizionale.

diagnostica del carcinoma endometriale e campioni di tessuto ottenuti dopo il raschiamento della membrana mucosa dell'utero.

Nel monitoraggio del carcinoma endometriale, la CA 125 è considerata il miglior marker: nel 60% dei pazienti con recidiva precoce del tumore, è stato riscontrato un aumento del CA 125.

4.4.5. CANCRO DEL POLMONE

Nei paesi economicamente sviluppati, la popolazione maschile di neoplasie maligne del cancro del polmone è del 21% nella struttura della mortalità totale. Il cancro del polmone è un prototipo di un tumore indotto da agenti cancerogeni chimici. È stata trovata una stretta relazione tra lo sviluppo del cancro del polmone e il fumo di sigaretta, ma non tutti i fumatori sviluppano il cancro, ma solo il 5-10%, che indica l'importante ruolo della predisposizione genetica in questi pazienti. In quasi il 50% dei casi, il trattamento chirurgico può essere raccomandato durante la diagnosi iniziale, ma solo nel 70% di essi il tumore è resecabile.

I principali tipi istologici di carcinoma polmonare sono: cellule squamose (PRL), adenocarcinoma, carcinoma a grandi cellule e carcinoma polmonare a piccole cellule (LMR). Va notato che l'LMR differisce da altri tipi istologici di tumori polmonari per le caratteristiche del suo decorso clinico. Pertanto, tutti i tumori polmonari maligni sono suddivisi in SCLC e carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC), che fanno parte di un gruppo eterogeneo di tumori.

Nel cancro del polmone, i seguenti marcatori sono più comunemente studiati: enolasi neuronale specifica (HCE), CEA, 19 frammento di citocheratina (CYFRA 21-1), antigene tumorale squamoso (SCC), CA 125, antigene polipeptidico tissutale (TPA).

L'enolasi specifica dei neuroni è stata trovata per la prima volta nei neuroni del cervello e nel sistema nervoso periferico. HSE è un isoenzima dell'enzima glicolitico citoplasmatico enolasi (2-fosfo-D-glicerato idrolasi, CE 4.2.1.11) e consiste di due catene polipeptidiche di tipo γ quasi identiche, il peso molecolare di ciascuna è 39.000 D. Nel cervello, insieme all'isoforma - un dimero da subunità α-tipo e un isoenzima αγ ibrido, che hanno un'affinità simile per il substrato - acido 2-fosfoglicerico. Un enolasi contenente questa subunità γ (α-γ e γ-γ) era chiamato HCE. Le isoforme possono essere sintetizzate da cellule cerebrali gliali, così come dalla maggior parte delle cellule somatiche.

tessuti. L'enzima stesso è sintetizzato nei neuroni centrali e periferici e nei tumori maligni di origine neuroectodermica (SCR, neuroblastomi, carcinoidi intestinali).

È dimostrato che il limite superiore di HSE nelle persone sane è 12,5 ng / ml. Considerando, tuttavia, che le concentrazioni fino a 20 ng / ml

e più possono verificarsi nelle malattie polmonari benigne, per la diagnostica clinica è preferibile un livello più alto del valore del marker di soglia (> 25 ng / ml). Un aumento nell'attività di HCE nel siero è stato rilevato nel 40-70% del primario

pazienti con IRL e nell'83-98% dei pazienti con uno stadio comune della malattia.

Secondo i dati forniti dal Memorial Sloan Kettering Cancer Center (USA), la frequenza di aumento dell'attività HCE nel siero dei pazienti con SCR dipende dalla prevalenza del processo tumorale: allo stadio I-II, la sensibilità del test è del 39%, allo stadio III-IV - 87%. Va notato che nell'analisi del significato diagnostico, molti autori identificano una specificità relativamente alta rispetto ad altri marcatori. Pertanto, l'attività nell'enfisema è aumentata solo in casi eccezionali, rispetto ai quali la concentrazione di CEA è aumentata nel 7-36% delle osservazioni. I risultati della ricerca indicano che l'HCE è abbastanza applicabile come marcatore tumorale di scelta, sia nella diagnosi differenziale che nel monitoraggio dell'efficacia della terapia per l'LMR.

Allo stesso tempo, è stato riscontrato un aumento dell'attività HCE nel siero di pazienti con tubercolosi (27,3%), nonché nei pazienti con infezione da HIV, rispetto a quelli non infetti. I pazienti con infiltrati alveolari o focolai interstiziali nei polmoni hanno anche livelli di HCE significativamente elevati nel siero. Si ritiene che un aumento della HSE sierica in pazienti con malattie polmonari benigne sia associato a ipossia locale. I risultati presentati dovrebbero essere considerati quando si analizza l'HCE nei pazienti con cancro del polmone e nei processi polmonari ostruttivi.

Va notato che, data la significativa eterogeneità del cancro del polmone, in particolare la variante delle piccole cellule, è possibile notare il significativo significato diagnostico e prognostico di HCE rispetto ad altri marcatori tumorali.

L'antigene cancro-embrionale, rappresentato da una glicoproteina con una massa molecolare di circa 180 kD, appartiene anche al gruppo

antigeni oncofetali, sintetizzati e secreti dalle cellule intestinali dell'embrione e del feto, nonché da alcuni tumori maligni (mammella, stomaco, cancro ai polmoni). Per la prima volta il CEA è stato trovato in pazienti con tumore del colon. Attualmente, i composti di tipo CEA sono stati rilevati anche sulle membrane cellulari nei tessuti non embrionali e non-cancerosi. Ci sono tutte le ragioni per credere che il fegato sia il principale sito metabolico del CEA. Il livello di CEA nel siero del sangue è aumentato nel 40-80% dei pazienti con neoplasie maligne di origine endodermica, nel 20-30% con altre forme di cancro e nel 10-20% con tumori benigni. La più alta sensibilità del CEA e le più alte concentrazioni del marcatore sono state riscontrate nell'adenocarcinoma e nel carcinoma polmonare a grandi cellule.

L'antigene del carcinoma squamoso del siero è una proteina con una massa molecolare di 48 kDa, che è simile alle serpi (inibitori della proteasi). Il marcatore viene utilizzato nella diagnosi del carcinoma a cellule squamose in vari organi (tumori della cervice, dell'esofago, polmone, tumori della testa e del collo). Più del 70% dei pazienti con PRL ha livelli elevati. Tuttavia, solo nel 26,1% del livello del marcatore tumorale aumenta nel siero con adenocarcinoma del polmone e non viene rilevato con SCR. Nell'87,8% dei pazienti con recidiva precoce di PRL si osserva un alto livello di SCC sierica. L'identificazione dell'espressione di SCC in uno studio immunoistochimico sui tumori del polmone ha una grande importanza pratica.

L'antigene polipeptidico del tessuto è una miscela polidispersa di citocheratine 8, 18 e 19 (peso molecolare da 20 a 45 kD), che può polimerizzare in soluzione per formare oligomeri. L'attività di TPA dipende dalla sequenza di amminoacidi e dalla posizione del residuo di arginina. Normalmente si trova in alte concentrazioni nella placenta e nei tessuti fetali. Il TPA è localizzato sulla membrana plasmatica e sul reticolo endoplasmatico delle cellule tumorali, è prodotto da cellule proliferanti e rilasciato spontaneamente nell'ambiente. Il TPA si trova in quasi tutti i tumori maligni.

Frammento di citocheratina 19. Il significato di citocheratina per la differenziazione del tessuto fisiologico e patologico è noto da lungo tempo nell'istopatologia. Le citocheratine sono proteine ​​cellulari insolubili, più di 20 sono ora caratterizzate da anticorpi monoclonali. Al contrario

dall'intera molecola, frammenti di citocheratina sono solubili nel siero. Nel test per il marcatore tumorale CYFRA 21-1, due tipi di anticorpi monoclonali (Ks 19.1 e BM 19.21) sono utilizzati per rilevare un frammento di citocheratina 19 con una massa molecolare di 30 kD. Il limite superiore del normale nelle persone sane è di 2,3 ng / ml. Il test CYFRA 21-1 ha una buona specificità per le malattie polmonari benigne, il livello di soglia è 3,3 ng / ml. Il marcatore ha un'alta sensibilità nella diagnosi di NSCLC.

Nessuna associazione di CYFRA 21-1 con il fumo. È stato dimostrato che il livello di CYFRA 21-1 è lo stesso nel siero di pazienti con malattie polmonari non maligne, SCLC e nel gruppo di controllo. Allo stesso tempo, sono stati osservati livelli significativamente più elevati di CYFRA 21-1 in pazienti con NSCLC, adenocarcinoma e PRL. I dati presentati hanno confermato l'elevata sensibilità e specificità di CYFRA 21-1 nella diagnosi differenziale tra malattie polmonari maligne e non maligne, nonché tra MRL e NSCLC. I pazienti con metastasi nei linfonodi N2 e N3 hanno il più alto livello di CYFRA 21-1 nel siero (5,6 ng / ml) (limiti di fluttuazione 3,2-11,5 ng / ml) rispetto ai pazienti con N0 e N1 (3.9-10 ng / ml) (Mann-Whitney U-test; p = 0.0373).

In tutti i tipi di cancro ai polmoni, CYFRA 21-1 ha la sensibilità più alta (57,7%) rispetto a CEA (45,3%) e SCC (22,6%). Sebbene la combinazione di CYFRA 21-1 e CEA per la diagnosi di NSCLC, la sensibilità e l'accuratezza siano aumentate rispettivamente al 75,4 e al 78,1%, ma la specificità diminuisce fino all'86,5%.

Ricercatori giapponesi (Università di Tsukuba) propongono di utilizzare la determinazione del livello di CYFRA 21-1 nel fluido pleurico in aggiunta all'esame citologico al fine di migliorare la diagnosi e la diagnosi differenziale del cancro del polmone. Ciò è dovuto al fatto che un aumento significativo del marcatore è stato rilevato nel liquido pleurico nei pazienti con cancro del polmone (84,5 ng / ml in media) rispetto ai pazienti con tumori benigni (13,9 ng / ml). Inoltre, il livello di CYFRA 21-1 nel liquido pleurico dei pazienti con PRL è significativamente diverso da quello della polmonite, mentre il CEA non rivela tali differenze.

Quando si determina CYFRA 21-1, si dovrebbe essere consapevoli del possibile aumento del livello fino a 10 ng / ml in caso di progressive malattie epatiche benigne e soprattutto in caso di insufficienza renale. La contaminazione del campione con elementi salivari può anche

portare ad un aumento significativo del valore di CYFRA 21-1. In questo caso, il risultato non influenza il sesso, l'età, il fumo e la gravidanza. Studi su tutti i tipi di tumori solidi hanno dimostrato che CYFRA 21-1 è un marcatore efficace per NSCLC e PRL.

In conclusione, consideriamo alcune caratteristiche dell'uso nella clinica di marcatori di crescita maligna sull'esempio del cancro del polmone.

Prima di tutto, non si dovrebbero usare tutti i marker sopra indicati per lo screening del carcinoma polmonare asintomatico o nei pazienti ad alto rischio di sviluppare questo tipo di tumore. La diagnosi primaria e il trattamento primario dei pazienti con carcinoma polmonare si basano su metodi clinici e strumentali di esame (clinici, endoscopici, radiologici, risultati intraoperatori).

Inoltre, il marker NSE dovrebbe essere considerato estremamente importante nella diagnosi immunoistochimica di una variante tumorale. Spesso, solo la determinazione dell'HCE nel siero aiuta a confermare la diagnosi di SCLC.

Una concentrazione di SCC sierica> 2 mg / l indica una probabilità del 95% di rilevare NSCLC e l'80% di carcinoma polmonare a cellule squamose.

A livelli di CA 125 superiori a 100 U / ml e CEA superiori a 10 mg / l, si deve suggerire l'adenocarcinoma o il carcinoma polmonare a grandi cellule.

Infine, anche se spesso la concentrazione sierica CYFRA 21-1, TPA, HCE, CEA mostra la presenza di un tumore, non viene osservato

una forte relazione tra la produzione di marcatori tumorali e la variante istologica di un tumore polmonare. Nella maggior parte dei casi, un livello elevato in questo caso indica la prevalenza del processo tumorale e, pertanto, la prognosi dovrebbe essere deludente. Tuttavia, i valori bassi e medi di questi marcatori non consentono mai di eliminare completamente qualsiasi variante del tumore o la progressione della malattia.

Nonostante tutte le limitazioni di cui sopra, i marcatori tumorali nella diagnosi primaria del cancro del polmone possono essere importanti nelle seguenti situazioni.

Innanzitutto, gli antigeni associati al tumore espressi durante la diagnosi iniziale dovrebbero essere utilizzati nel monitoraggio in un dato paziente. CYFRA 21-1, REA e CA 125 sono fattori prognostici altamente significativi nel NSCLC e HCE nell'MRL.

In secondo luogo, una diminuzione del livello dei marcatori tumorali nel periodo postoperatorio (

2-3 giorni per CEA, 1 giorno per NSE, poche ore

per CYFRA 21-1) fornisce al medico informazioni utili sulla natura radicale della chirurgia eseguita e sull'efficacia della terapia e, quindi, su una buona prognosi. D'altra parte, una lenta diminuzione del livello del marcatore nel siero del sangue indica la non-dicalità dell'operazione e suggerisce la presenza di focolai tumorali residui.

Terzo, un graduale aumento dell'indice tumorale può essere il primo segno di una recidiva della malattia. Un tale aumento può essere rilevato 12 mesi prima dei segni clinici di recidiva. Per il cancro del polmone, l'HCE può servire come criterio per la diagnosi differenziale di vari tipi istologici di un tumore, specialmente nei casi in cui non è possibile eseguire una biopsia e confermare il tipo di tumore con dati morfologici.

4.5. DIAGNOSTICA GENETICA MOLECOLARE

Il compito principale della moderna diagnostica genetica molecolare (MHD, diagnostica del DNA) è la rilevazione di anomalie ereditarie per l'uso successivo nella diagnosi, fare una previsione e scegliere una strategia di trattamento per molte malattie. Allo stesso tempo, la MHD è considerata molto più ampia della semplice analisi della sequenza del DNA genomico umano, poiché quasi sempre ulteriori informazioni sulla malattia ereditaria possono essere ottenute anche analizzando lo stato dei cromosomi stessi e l'RNA, le proteine ​​e i metaboliti.

Come altri metodi di biochimica clinica, i test genetici sono utilizzati per la diagnosi differenziale delle malattie. In un certo numero di malattie, ad esempio, in forme ereditarie di cancro o "errori di metabolismo", la rilevazione di mutazioni diventa un criterio diagnostico importante quanto i sintomi clinici. Tuttavia, ovviamente, il principale vantaggio della diagnostica del DNA è la capacità di determinare la suscettibilità a una particolare malattia allo stadio presintomatico. In alcuni casi, ciò rende possibile prevenire lo sviluppo della malattia stessa mediante intervento chirurgico, terapia farmacologica o modificando lo stile di vita del paziente. Inoltre, il test del DNA prenatale può rilevare l'ereditarietà dei geni patologici e, di conseguenza, determinare le indicazioni per l'interruzione artificiale della gravidanza.

È necessario notare una direzione così promettente della MHD come farmacogenetica. La tipizzazione accurata del genotipo del paziente consente la valutazione dei geni direttamente correlati all'assorbimento, al metabolismo e all'azione del farmaco, cioè, vi è una reale opportunità di identificare i pazienti particolarmente sensibili a un particolare farmaco e di evitare complicazioni dovute a intolleranza a questo farmaco durante il trattamento. In alcuni casi, la genotipizzazione consente anche di scegliere il farmaco più appropriato. Già, è sicuro dire che con lo sviluppo della farmacogenetica, la terapia farmacologica farà sempre più affidamento sull'analisi del genotipo del paziente.

Pertanto, l'uso della MHD nella pratica clinica offre ampie opportunità non solo per diagnosticare e valutare il rischio genetico delle malattie, ma anche per la selezione della terapia farmacologica individuale. Si spera che lo sviluppo attivo della genetica molecolare umana metterà la diagnostica del DNA alla pari con strumenti indispensabili nell'arsenale di un medico biochimico, come ad esempio i metodi per determinare l'attività degli enzimi nel sangue.

4.5.1. TIPI DI RICOSTRUZIONE GENETICA

Nella popolazione ci sono di solito diverse varianti (alleli) di ciascun gene. Se la frequenza di tali varianti è piuttosto alta e non può essere spiegata dall'occorrenza accidentale di mutazioni identiche in famiglie diverse, allora parliamo di un polimorfismo di un dato locus.

Le varianti più rare dei geni sono indicate come mutazioni. Qual è il confine tra polimorfismo e mutazioni? Si ritiene che il polimorfismo includa varianti di geni che si trovano più nella forma eterozigote e mutazioni inferiori all'1% della popolazione. Tuttavia, nella pratica, i mutanti sono spesso chiamati alleli che predispongono a una particolare patologia, anche se la loro frequenza nella popolazione è superiore all'1%. Di seguito sono elencati i tipi di mutazioni che possono portare a cambiamenti patologici.

• Le mutazioni missenso, o la sostituzione dei nucleotidi, sono il tipo più comune di mutazione. La sostituzione di nucleotidi in alcune posizioni di codone non porta alla sostituzione dell'amminoacido codificato; tali mutazioni sono dette silenziose o sinonimi. Quando l'amminoacido codificato cambia come risultato di una mutazione missenso, la funzione della proteina cambia spesso. La conservazione della funzione della proteina è osservata se

l'amminoacido derivato dal codone mutante appartiene alla stessa classe strutturale del normale amminoacido. Le sostituzioni con un singolo nucleotide hanno il massimo effetto sulle proteine, con la conseguente formazione di un codone di stop (mutazioni senza senso). L'mRNA e le proteine ​​troncati sono spesso inattivi e si degradano rapidamente.

• Cancellazioni e inserimenti. Tali mutazioni variano in lunghezza da uno a milioni di nucleotidi e, di conseguenza, sono chiamate micro e macro-delezioni (inserzioni). Comprensibilmente, le macromutazioni influenzano i segmenti cromosomici molto grandi (da 10 milioni di paia di basi), vale a dire. diventa possibile rilevarli utilizzando l'analisi citogenetica. Le micromutazioni influenzano una piccola quantità di nucleotidi e vengono utilizzati metodi per analizzare la sequenza nucleotidica del DNA. Piccole inserzioni e delezioni potrebbero non influire sulla funzione della proteina codificata. Le conseguenze fatali si osservano di solito quando il numero di nucleotidi di inserimento / cancellazione non è un multiplo di tre. Quando ciò accade, viene modificato il frame di lettura e viene sintetizzata una sequenza di amminoacidi priva di significato. Molto spesso, viene interrotto molto rapidamente dalla formazione di un nuovo codone di stop. Un classico esempio dell'effetto di un frame shift sugli effetti di una delezione è rappresentato da due malattie correlate: la distrofia muscolare di Duchenne e Becker. Entrambi sono causati da mutazioni nel gene della distrofina e 2/3 di queste mutazioni sono in entrambe le malattie della delezione. La distrofia muscolare di Becker è molto più mite di quella di Duchenne, ma questa differenza non è correlata alla dimensione delle delezioni. La ragione delle differenze è che nella maggior parte dei casi rilevati di miodistrofia di Duchenne, le delezioni portano a uno spostamento nel fotogramma di lettura e, di conseguenza, la distrofina cessa di formarsi completamente, mentre con la miodistrofia di Becker, la distrofina mutante mantiene una certa attività.

• In alcuni casi, le mutazioni influenzano le regioni non codificanti del DNA che sono coinvolte nell'iniziazione della trascrizione di un dato gene o splicing di mRNA. Tali cambiamenti possono anche portare all'interruzione della struttura, alla stabilità o alla normale regolazione dell'espressione di questa proteina.

• Le mutazioni instabili o dinamiche di solito si sviluppano in aree contenenti più copie di ripetizioni trinucleotidiche. Come risultato di errori di replicazione del DNA o di incroci ineguali, il numero di tali ripetizioni può aumentare o diminuire, come risultato di tali mutazioni chiamate dinamiche. Se il numero

le ripetizioni superano un certo valore di soglia, la funzione di un dato o di geni vicini viene disturbata. I meccanismi per spegnere i geni durante l'accumulo di ripetizioni trinucleotidiche non sono del tutto chiari. In particolare, nella sindrome del cromosoma X fragile, un aumento del numero di ripetizioni della CGG nel locus FRAXA superiore a 200 porta alla metilazione e alla inattivazione di questo gene. L'aumento del numero di ripetizioni di trinucleotidi è anche alla base della malattia di Huntington (oltre 35 ripetizioni CAG nel gene Huntington) e della distrofia miotonica (oltre 50 ripetizioni nella regione 3'-non tradotta del gene DMPK che codifica per la protein-chinasi). Una caratteristica di queste malattie è che in una famiglia la gravità della malattia può aumentare in un numero di generazioni a causa dell'espansione delle ripetizioni nucleotidiche.

In generale, la comparsa di mutazioni porta a un cambiamento nella funzione o nell'espressione della proteina. Questo cambiamento si manifesta come un aumento e una diminuzione, spesso fino a una completa perdita, funzione o espressione della proteina. Nel caso di un aumento funzionale, è anche possibile che una proteina acquisisca nuove funzioni.

FUNZIONI MOVIMENTI CON PERDITA

Una diminuzione dell'attività funzionale di una proteina in un tessuto può essere il risultato di un cambiamento sia della struttura della proteina che dell'attività trascrizionale di un dato gene. Ad esempio, una diminuzione del livello di espressione del recettore LDL a causa di una mutazione nella regione del promotore porterà esattamente alla stessa ipercolesterolemia che verrebbe osservata se fossero sintetizzate quantità normali di un recettore funzionalmente difettoso che non potesse legare o interiorizzare le lipoproteine.

Cambiamenti nella struttura delle proteine ​​causati da sostituzioni di aminoacidi o interruzione del processo di mRNA come risultato di mutazioni nei siti di splicing porta alla comparsa di anormale mRNA e proteine ​​che sono soggette a degradazione accelerata, con conseguente diminuzione della quantità totale di proteine ​​attive. Ad esempio, i tre più comuni difettivi di tiopurina metil transferasi gene codificano proteine ​​a degradazione rapida, con conseguente brusco calo dell'attività enzimatica, che è accompagnata da una maggiore sensibilità dei pazienti alle tiopurine. In altri casi, come ad esempio l'a-talassemia, si può osservare una delezione dell'intero gene, portando ad una completa assenza del prodotto.

I meccanismi di perdita della reale attività funzionale della proteina possono essere molto diversi. Di conseguenza, le mutazioni possono

sostituzione di aminoacidi che svolgono un ruolo chiave nella struttura o attività catalitica. Come risultato di mutazioni, il normale trattamento o il trasporto di proteine ​​possono essere interrotti. Ad esempio, la mutazione più frequente che causa la fibrosi cistica, una delezione di fenilalanina in posizione 506 del gene CFTR, non influenza la sintesi o l'attività funzionale di questa proteina, ma interrompe il suo trasporto intracellulare, in conseguenza della quale non è incorporata nella membrana plasmatica e quindi perde la sua capacità di funzionare come un canale di cloro.

Di regola, le mutazioni con perdita di funzione portano a malattie con una modalità recessiva di ereditarietà. Ciò è dovuto al fatto che per il pieno funzionamento del percorso metabolico di solito è sufficiente la quantità di proteina attiva, che è prodotta da un normale allele. E la maggior parte di queste malattie.

Meno comuni sono i casi in cui la quantità di proteine ​​sintetizzate diventa insufficiente. In questo caso, la malattia inizierà ad apparire anche se esiste un allele mutante e l'ereditarietà diventa dominante. Poco si sa di tali malattie, una delle quali è l'ipercolesterolemia familiare causata da un difetto nel gene del recettore LDL. Questa malattia è anche caratterizzata dall'effetto di una dose di gene, che si manifesta nel fatto che l'ipercolesterolemia familiare è molto più grave negli omozigoti rispetto agli eterozigoti.

Il tipo dominante di ereditarietà si manifesta quando la proteina mutante non solo perde la sua attività, ma interferisce anche con il funzionamento del prodotto dell'allele normale negli eterozigoti. Questa situazione è stata inclusa nella letteratura chiamata effetto dominante negativo. Questo effetto si trova nel caso di proteine ​​multimeriche, che, in particolare, includono collageni o fattori di trascrizione dimerica.

MUTAZIONI CON FUNZIONI DI ACQUISTO

Tra l'ampia gamma di funzioni che migliorano la mutazione, i più interessanti dal punto di vista della biochimica clinica sono i casi in cui la proteina acquisisce una nuova funzione. La funzione appena acquisita può verificarsi a livelli quali l'interazione dell'enzima con un nuovo substrato, l'attivazione irreversibile della proteina trasmittente del segnale o del canale ionico, la distruzione del normale processo di inattivazione dell'enzima, l'oligomerizzazione anomala della proteina o la sintesi della proteina chimerica.

La messaggistica errata di Ala è un buon esempio dell'acquisizione di una funzione.366-Gray nel gene GNAS1 che codifica per la subunità α della proteina legante GTP eterotrimerica. Questa proteina accoppia i recettori dell'ormone transmembrana a 7 domini con adenilato ciclasi. La mutazione porta a un doppio cambiamento nelle proprietà della proteina. In primo luogo, il rilascio del PIL è accelerato e, di conseguenza, la frazione della proteina ασ (attiva) legata al GTP aumenta, il che porta a un'attivazione costitutiva dell'adenilato ciclasi. In secondo luogo, la proteina diventa termolabile a 37 ° C. A questo proposito, in tutti gli organi, ad eccezione del testicolo, diminuisce l'attività di Gs, che porta allo sviluppo dell'osteodistrofia ereditaria Albright. E nel testicolo, dove la temperatura è inferiore, la proteina Gs viene attivata in modo irreversibile, il che porta a testoxicosis.

La ragione più comune per l'acquisizione della funzione è l'aumento dell'espressione del gene o una violazione del luogo o del tempo della sua espressione, che è la più caratteristica delle cellule trasformate malignamente.

Per le mutazioni con l'acquisizione di una funzione, di regola, il tipo dominante di ereditarietà è caratteristico. In quei rari casi in cui le mutazioni con l'acquisizione della funzione sono in uno stato omozigote, si osservano forme molto gravi della malattia, spesso con mortalità prenatale. Un esempio è l'acondroplasia omozigote, la causa più comune di nanismo, che è causata da mutazioni nel gene FGFR3, che codifica per un recettore per il fattore di crescita dei fibroblasti. Le delezioni del sito del cromosoma su cui si trova FGFR3 in altre malattie non portano ad anomalie scheletriche caratteristiche dell'acondroplasia, che suggerisce il miglioramento o l'acquisizione della funzione in questa malattia. L'acondroplasia si trova sempre nella forma eterozigote, poiché l'omozigosità per questo tratto è letale.

PRINCIPI DI RICERCA DI MUTAZIONI

L'approccio generale alla ricerca di mutazioni nel DNA genomico umano si basa su una serie di principi.

L'uso di un metodo o di un altro nella diagnostica del DNA dipende dalla disponibilità di informazioni sul possibile tipo di mutazione in un dato paziente. Nei casi in cui il tipo di mutazione non è noto, vengono utilizzati metodi di screening per rilevare eventuali differenze nella sequenza nucleotidica dei geni mutanti e normali. Se la mutazione è nota, ad esempio, è già stata identificata nei parenti, altri più semplici sono usati per l'esame.

e allo stesso tempo metodi più efficaci che possono essere chiamati metodi di rilevamento di mutazioni note.

Inoltre, indipendentemente dalla direttività (screening o rilevamento) del metodo scelto, è necessario tener conto che un gruppo di metodi è basato sulla specificità dell'accoppiamento nucleotidico nella formazione di un doppio filamento di DNA e l'altro sul riconoscimento della sequenza di DNA da parte degli enzimi.

Per il primo gruppo di metodi, i frammenti della sequenza del gene in studio, corrispondente al tipo selvaggio, cioè il più comune nella popolazione, vengono utilizzati come sequenza di riferimento. Questo può essere un breve primer oligonucleotidico (circa 20 nucleotidi) o un frammento di DNA più lungo utilizzato per l'ibridazione. Nel caso in cui il DNA del paziente contenga una mutazione nella regione coperta dal campione, l'ibridazione a pieno titolo tra l'allele mutante e il campione è impossibile. Ciò porta sia all'assenza del prodotto della reazione a catena della polimerasi (PCR), sia alla formazione di un duplex di DNA inadeguato contenente regioni nucleotidiche non appaiate, che sono rilevate da vari metodi chimici o enzimatici.

Un classico esempio di un metodo basato sul riconoscimento delle sequenze di DNA da parte degli enzimi è l'uso di enzimi di restrizione, enzimi che scindono il DNA in regioni contenenti sequenze strettamente individuali di 4-8 nucleotidi in lunghezza. La comparsa di deviazioni nella sequenza nucleotidica a seguito di una mutazione può portare alla perdita di un sito di clivaggio già esistente per qualsiasi enzima di restrizione o, al contrario, al suo aspetto. Nello stesso gruppo di metodi, vengono utilizzati enzimi DNA polimerasi. Questi enzimi sintetizzano una catena complementare in conformità esatta con la sequenza di una matrice a filamento singolo. Utilizzando blocchi nucleotidici marcati, è possibile determinare in quale sequenza i nucleotidi si trovano in una data matrice. Questo principio è alla base del sequenziamento enzimatico (determinazione della sequenza nucleotidica) secondo il metodo di Sanger, così come nelle sue versioni semplificate, progettato per determinare la sequenza nucleotidica di brevi sezioni di DNA (mini-sequenziamento).

Nella stragrande maggioranza dei casi, prima dell'analisi delle mutazioni corrette, il frammento studiato del genoma del paziente viene amplificato mediante PCR. L'obiettivo della PCR è solitamente una semplice moltiplicazione.

il numero di copie di questo frammento, che facilita l'analisi del DNA tecnicamente successiva (Figura 4.3). Nella maggior parte delle varianti di PCR negli eterozigoti, gli alleli sia normali che mutanti sono amplificati con la stessa efficienza e la loro discriminazione viene effettuata nelle fasi successive. C'è anche un allele specifico

Fig. 4.3. Schema di reazione a catena della polimerasi

PCR, in cui vengono utilizzati primer omologhi rispetto all 'allele normale o mutante, che consente di determinare la presenza di una mutazione già allo stadio PCR dalla presenza o dall'assenza di un prodotto di amplificazione.

Un altro metodo universale comunemente usato per diagnosticare le mutazioni è il sequenziamento del DNA. Il sequenziamento viene utilizzato sia per cercare mutazioni sconosciute sia per confermare le violazioni rilevate da altri metodi. I metodi esistenti consentono il sequenziamento diretto dei prodotti della PCR, evitando la clonazione del frammento PCR nei batteri. Il vantaggio del sequenziamento è la versatilità e altamente informativo. Il limite principale di questo metodo è il costo elevato, che non consente di utilizzarlo come principale durante la ricerca di mutazioni.

Il numero di metodi esistenti per analizzare le mutazioni è estremamente ampio e la loro descrizione senza esagerazione richiederà un libro separato. Di seguito sono riportate le descrizioni dei soli metodi che sono meglio adattati per l'uso nella pratica clinica, vale a dire soddisfare i seguenti requisiti: sufficiente sensibilità per identificare mutazioni, buona riproducibilità, basso costo e possibilità di automazione.

METODI DI PROIEZIONE MUTAZIONALE

I metodi di screening mutazionale sono usati nei casi in cui la natura della mutazione è sconosciuta e il quadro clinico della malattia ereditaria suggerisce in quali particolari geni potrebbe verificarsi un riarrangiamento. Ad esempio, la presenza di ipercolesterolemia IIa in combinazione con xantoma tendineo indica la presenza di ipercolesterolemia familiare e suggerisce che la mutazione debba essere ricercata nei geni associati alla cattura delle cellule LDL, principalmente nel gene del recettore LDL. Poiché le mutazioni in questo gene con ipercolesterolemia familiare sono molto diverse e possono interessare l'intera lunghezza del gene, è necessario analizzare ampie porzioni di DNA. Il sequenziamento di un frammento di un gene così lungo è troppo costoso, pertanto vengono utilizzati metodi più semplici.

ANALISI DEL BLOCCO DEL DNA PER IL MACRO-RIPRISTINO

Per cercare il DNA macroscopico usando il Southern blotting. In questo metodo, il DNA genomico viene inizialmente frammentato usando l'enzima di restrizione, dopodiché il risultante

I frammenti di DNA sono separati mediante elettroforesi su gel, denaturati e trasferiti su una membrana di nitrocellulosa. Il DNA sulla stampa ottenuta dal gel (macchia) viene incubato con un frammento marcato del gene in esame, che si ibrida con quei frammenti di DNA genomico che contengono il gene. In presenza di DNA macroscopico che colpisce questo gene, l'insieme o la dimensione dei frammenti con cui il campione marcato si ibrida sarà diverso dalla norma.

Fig. 4.4. Analisi eteroduplex

ANALISI HETERODUPLEX La ricerca di microdelezioni / inserzioni con una dimensione inferiore a 25 coppie di basi e sostituzioni di nucleotidi singoli è più difficile. Per la loro analisi, vengono spesso utilizzate varianti speciali di metodi elettroforetici. Una delle più semplici è l'analisi eteroduplex (Fig. 4.4). In questo metodo, un campione contenente una miscela del frammento normale (di riferimento) e del DNA amplificato in esame viene riscaldato per denaturare il DNA e quindi raffreddato con il ripristino della struttura del DNA a doppio filamento. Poiché la presenza di piccole differenze nella sequenza nucleotidica non impedisce l'ibridazione, una parte dei duplex risultanti è costituita dal riferimento e dal DNA testato. Nelle aree di riferimento e test del DNA, che differiscono nella composizione del nucleotide, l'associazione normale dei nucleotidi è impossibile e si forma la cosiddetta mancata corrispondenza. Il DNA a doppio filamento, che ha una mancata corrispondenza nella sua struttura, sull'elettroforesi migra in modo diverso rispetto a un duplex completamente complementare, il che rende possibile rilevare frammenti che migrano in modo anomalo dopo la colorazione del DNA.

ANALISI DEL POLIMORFISMO DELLA CONFORMAZIONE DEL DNA SINGLE-GRANN

Un altro metodo elettroforetico popolare di screening mutazionale è il polimorfismo di conformazione del polimorfismo di conformazione a singolo filamento (SSCP). Il principio del metodo si basa sul fatto che se il denaturato riscaldando il DNA viene raffreddato bruscamente, non si formeranno prevalentemente duplex a doppio filamento, ma brevi regioni a doppio filamento all'interno di ciascun frammento di DNA a filamento singolo (Fig. 4.5). Di solito, vengono formate diverse varianti relativamente stabili che, a causa della diversa conformazione spaziale, migrano in modi diversi sull'elettroforesi. Le aree di complementarità intrachain sono generalmente brevi, e ogni cambiamento come risultato anche di una sostituzione con un singolo nucleotide porta solitamente alla scomparsa di questa forma di duplex intrachain. Di conseguenza, la distribuzione e l'intensità delle bande di DNA a filamento singolo cambiano sull'elettroforegramma. Questo metodo non dice nulla sulla natura delle differenze nella sequenza nucleotidica, quindi i campioni anormali devono essere sequenziati.

Fig. 4.5. Analisi del polimorfismo della conformazione del DNA a filamento singolo

ELETTROFORESI DELL'ARCHITETTURA DEL DNA Β GRADIENTE DENATURANTE Più elettrochimicamente riproducibile e informativo di SSCP è l'analisi elettroforetica del DNA in un gradiente denaturante (Fig. 4.6). Ovviamente, qualsiasi sostituzione di nucleotidi porterà a un cambiamento nella forza del duplex del DNA, e si denaturerà in catene singole a temperatura anomala o concentrazione dell'agente denaturante rispetto alla sequenza normale. In questo metodo, l'elettroforesi viene effettuata in gel di poliacrilammide contenenti una maggiore concentrazione di denaturante nella parte inferiore rispetto alla parte superiore. Durante l'elettroforesi, frammenti di DNA normali e mutanti sono denaturati in diverse parti del gel. Poiché la mobilità delle singole catene risultanti è molto più bassa,

Fig. 4.6. Elettroforesi in un gradiente denaturante

rispetto al DNA a doppio filamento (a causa delle caratteristiche conformazionali del DNA a filamento singolo), il frammento denaturato rallenta bruscamente la migrazione, mentre il doppio filamento continua a muoversi. Β Di conseguenza, frammenti di DNA normali e mutanti migrano a diverse distanze nel gel. A volte come denaturante non usare una sostanza chimica, ma un gradiente di temperatura.

DENATURING LIQUIDO CARBURANTE

CROMATOGRAFIA Le differenze nella forza dei duplex normali e mutanti possono anche essere rilevate utilizzando la cromatografia liquida ad alte prestazioni denaturante. In questo metodo, un frammento di DNA, analogamente ai metodi elettroforetici descritti sopra, è esposto a un gradiente di agenti denaturanti, ma l'analisi del DNA viene effettuata mediante un metodo cromatografico mediante rivelazione spettrofotometrica. Questo metodo è altamente sensibile e facile da automatizzare e pertanto viene sempre più utilizzato per la diagnostica clinica del DNA.

RILEVAZIONE CHIMICA DEL NUCLEOTIDE DISPONIBILE Il secondo gruppo di metodi si basa sul rilevamento di mutazioni utilizzando enzimi o processi chimici che distruggono specificamente le aree di accoppiamento non complementare.

Il frammento di DNA analizzato viene denaturato, miscelato con un campione di controllo contenente DNA normale e raffreddato per formare i duplex, alcuni dei quali, se il paziente presenta mutazioni, conterranno aree di basi non appaiate. Il trattamento del DNA eteroduplex con idrossilammina o tetrossido di osmio porta alla modificazione di nucleotidi non accoppiati contenenti citosina e timidina. Il successivo trattamento con piperidina porta alla scissione del DNA a livello del nucleotide. Di conseguenza, le dimensioni del DNA sono conservate in campioni normali e quelle mutanti contengono un insieme di frammenti corrispondenti a mutazioni che interessano i nucleotidi C o T. Questo metodo non è ampiamente utilizzato, probabilmente a causa dell'alta tossicità dei reagenti utilizzati.

PROTEZIONE CONTRO RNKAZY In un altro metodo, la presenza di nucleotidi non accoppiati viene determinata utilizzando l'enzima RNasi. Questo metodo utilizza una sonda RNA marcata corrispondente ad una normale sequenza genica, che si ibrida con il frammento di DNA oggetto di studio (Fig. 4.7). Come parte del duplex DNA / RNA, l'RNA è resistente a RNase, quindi questo metodo è chiamato protezione contro RNase. Tuttavia, in regioni diverse nella sequenza nucleotidica tra il campione e il campione da analizzare, l'accoppiamento dei nucleotidi non si verifica. La formazione di frammenti di RNA è registrata mediante elettroforesi. Questo metodo è una delle mutazioni più sensibili e specifiche per lo screening, ma non è stato ampiamente utilizzato, apparentemente a causa del disagio nel lavorare con sonde di RNA labili. Esistono altri metodi basati sul riconoscimento enzimatico di basi spaiate; non è chiaro quanto ampiamente saranno utilizzati nella diagnosi clinica.

MUTAZIONI DI MUTAZIONI DIAGNOSTICHE I metodi elettroforetici di screening mutazionale sono la sensibilità non assoluta, di solito rilevano solo circa la metà delle mutazioni e dei polimorfismi nei frammenti analizzati, e solo la sensibilità della denaturazione

l'elettroforesi si avvicina al 100%. Combinato con costi relativamente bassi e la possibilità di automazione, questo metodo diventa sempre più popolare.

Un'altra caratteristica dei metodi di screening è che, con risultati positivi, è richiesta un'ulteriore analisi dell'enzima di sequenziamento o restrizione perché i metodi di screening non lo sono

Fig. 4.7. Metodo di protezione RNase

dare qualsiasi informazione sulla natura delle differenze nucleotidiche. Quando si esegue la diagnostica del DNA, non è sufficiente rilevare una deviazione nella sequenza nucleotidica in un paziente, portando alla sostituzione dell'amminoacido codificato. È necessario confermare che questa sostituzione di amminoacidi è funzionalmente significativa. Il metodo diretto consiste nell'ottenere una proteina mutante ricombinante e determinarne l'attività. Questo approccio dispendioso in termini di tempo e costoso è utilizzato principalmente per scopi di ricerca. In pratica, più spesso sono guidati dal tipo di sostituzione degli aminoacidi. Nel caso in cui gli aminoacidi normali e mutanti appartengano a classi strutturali diverse, la probabilità di cambiamenti funzionali nella proteina è maggiore. La probabilità di disfunzione della proteina è anche maggiore se la mutazione interessa parti conservate evolutivamente del gene, cioè quelle disposizioni in cui lo stesso amminoacido è presente in diverse specie di mammiferi. La presenza di tali siti di solito influenza la sintesi, il trasporto o il funzionamento della proteina, e qualsiasi cambiamento in essi influisce sull'attività della proteina. Ad esempio, l'analisi sequenziale del gene del recettore LDL, coniglio, topo, topo e Xenopus laevis di criceto cinese ha dimostrato, rispettivamente, 81, 79, 77, 76 e 70% di omologia nei confronti del recettore umano. Il database UMD-LDLR accessibile via Internet contiene una serie di programmi per l'analisi delle mutazioni nel gene del recettore LDL, compresa la possibilità di analizzare il conservatorismo di ciascun segmento genico.

Ulteriori informazioni sulla patogenicità della mutazione possono essere ottenute esaminando i parenti del paziente. Nel caso in cui la stessa mutazione sia presente nei parenti del paziente con segni di questa malattia (ad esempio, livelli elevati di colesterolo nell'ipercolesterolemia familiare), ma è assente in individui sani (più di 100 donatori sono generalmente sottoposti a screening senza segni di questa malattia), la probabilità che Questa mutazione è patogena, molto alta.

In generale, nonostante la sensibilità non assoluta dei metodi di screening delle mutazioni, il rapporto tra il contenuto informativo e il costo di questi metodi è piuttosto elevato e nella pratica sono ampiamente utilizzati. Va tuttavia tenuto presente che il loro potere predittivo negativo è limitato. In altre parole, l'assenza di qualsiasi caratteristica del campione di DNA quando analizzata con metodi di screening non significa che questo DNA non contenga mutazioni.

METODI DI RILEVAZIONE DELLA MUTAZIONE

Nel caso in cui siano note le possibili varianti dei riarrangiamenti genetici e non ce ne siano molte, è possibile utilizzare metodi più veloci e più economici rispetto ai metodi di screening mutazionale. Questi metodi si basano sull'ibridizzazione del DNA o sulla capacità degli enzimi di restrizione di riconoscere sequenze nucleotidiche ben definite o DNA polimerasi per sintetizzare DNA complementare alla matrice (mini-sequenziamento).

Fig. 4.8. Analisi di restrizione

ANALISI DI RESTRIZIONE Il metodo più semplice per rilevare le mutazioni è l'analisi della restrizione (figura 4.8). La base di questo metodo è una specificità molto elevata di endonucleasi di restrizione rispetto ad alcune sequenze nucleotidiche. Ognuno di questi enzimi batterici riconosce una sequenza strettamente individuale di 4-8 nucleotidi e taglia un doppio filamento di DNA all'interno o vicino a questo sito. È sufficiente sostituire un nucleotide per violare la restrizione di questo enzima. Nei casi in cui il nucleotide polimorfico fa parte del sito di restrizione, può essere genotipizzato con affidabilità al 100% utilizzando un enzima di restrizione. Le sostituzioni di nucleotidi violano molto spesso i siti di restrizione esistenti, ma a volte creano nuovi siti. Lo svantaggio del metodo è che i nucleotidi polimorfici non si trovano sempre nei siti di riconoscimento di qualsiasi restrizione. Una soluzione parziale è possibile nei casi in cui l'area in cui si trova la mutazione contiene almeno alcuni dei nucleotidi che costituiscono il sito di restrizione. Un sito di restrizione completo può essere creato artificialmente durante la PCR. Per fare ciò, utilizzare primer che non corrispondono completamente alla sequenza di nucleotidi nell'area della mutazione, ma contenenti 1-2 nucleotidi non complementari che completano il sito di restrizione, che includerà il nucleotide polimorfico. Solitamente, l'introduzione di un piccolo numero di basi non complementari riduce leggermente l'efficienza della PCR, quindi, dopo l'amplificazione, appare un nuovo sito di restrizione nel prodotto, nel quale è coinvolto anche il nucleotide polimorfico. Un'ulteriore analisi di restrizione viene eseguita allo stesso modo del metodo standard.

PCR ALLELSPECIFICA In alcuni casi, la PCR può essere utilizzata non per arricchire il frammento studiato del DNA genomico, ma per rilevare direttamente la mutazione (Fig. 4.9). In questa forma di realizzazione, uno dei primer si ibridizza con una regione di DNA entro la quale si trova un nucleotide polimorfico. La temperatura di annealing dei primer viene selezionata in modo che il legame del primer e la successiva amplificazione avvengano solo con la completa coincidenza delle sequenze di DNA e del primer. Ad esempio, quando un primer corrispondente alla sequenza mutante si lega ad un normale DNA, si forma un nucleotide non appaiato, che riduce la forza del primer che si lega al DNA. Ad un primer di temperatura di ricottura sufficientemente alto

Fig. 4.9. Reazione a catena della polimerasi allele-specifica

generalmente cessa di legarsi al normale allele, la PCR non procede e il prodotto non si accumula. Di solito, una reazione con un primer corrispondente all'allele normale viene messa in parallelo. Questa reazione funge da controllo positivo, mostrando il normale corso dell'amplificazione. Poiché la presenza di un disadattamento può ridurre leggermente la resistenza del legame del primer al DNA, a volte un secondo disadattamento viene introdotto nella sequenza di primer per destabilizzare ulteriormente il duplex e ridurre la resa del prodotto in presenza di un nucleotide non appaiato nella regione polimorfa.

PCR Β REALI REALI

Il vantaggio del metodo PCR allele-specifico sopra descritto è la riduzione del numero di fasi nella procedura di analisi, poiché non richiede l'elaborazione del prodotto con restrizioni o l'uso di metodi elettroforetici complessi.

Ancor più, il metodo viene accelerato utilizzando la PCR in tempo reale (RT-PCR). In questo metodo, la formazione del prodotto non viene monitorata mediante elettroforesi, come nel metodo standard PCR, ma direttamente durante la PCR per l'accumulo di DNA a doppio filamento nel mezzo di reazione. L'accumulo di DNA viene determinato dopo ogni ciclo di polimerizzazione aumentando la fluorescenza del colorante SYBR Green o dei suoi analoghi, la cui fluorescenza aumenta drammaticamente quando interagisce con il DNA a doppio filamento, ma non dipende dalla presenza di nucleotidi o primer. Gli strumenti per RT-PCR sono una combinazione di amplificatore PCR e fluorimetro. Una volta completata l'amplificazione, la specificità del prodotto ottenuto può essere determinata misurando il punto di fusione, che viene monitorato per ridurre la fluorescenza di SYBR Green.

TESTING TAQMAN Esistono altri modi per registrare un prodotto PCR direttamente nella miscela di reazione senza elettroforesi. Il metodo, brevettato da Hofmann LaRoche, si basa sulla rilevazione del DNA amplificato utilizzando una sonda oligonucleotidica che si ibrida con la parte centrale della sequenza amplificata. Alle estremità dei campioni di oligonucleotidi, chiamati TaqMan, sono i nucleotidi etichettati con due diversi coloranti fluorescenti, uno dei quali estingue la fluorescenza dell'altro. Come risultato della tempra, il livello di fluorescenza del secondo colorante è piccolo. Taq polimerasi, che completa un nuovo filamento da uno dei primer, divide il campione di TaqMan, che si lega al centro della regione amplificata del DNA, a causa della sua attività di esonucleasi, con conseguente rilascio dei nucleotidi marcati in fluorescenza nella soluzione e scomparsa dell'effetto di spegnimento, poiché è osservato solo in caso in cui i fluorofori si trovano vicini l'uno all'altro. Di conseguenza, la fluorescenza del colorante aumenta tanto più i campioni di oligonucleotidi sono stati distrutti dalla DNA polimerasi durante l'amplificazione, vale a dire più prodotto si forma. Questo metodo viene anche utilizzato per analizzare le mutazioni. Per questo, vengono utilizzati due campioni TaqMan, etichettati con coppie di fluorofori diverse e differenti nella sequenza nucleotidica nella regione polimorfa, una delle quali corrisponde al tipo selvaggio e l'altra a quella mutante. Degradazione del campione di DNA polimerasi

Fig. 4.10. Sonde TaqMan. P - colorante reporter, fluorescenza T - quencher

è effettuato a una temperatura a cui sono memorizzati solo complessi completamente complementari tra il frammento analizzato e campioni. Aumentando la fluorescenza dei coloranti che costituiscono il campione normale o mutante, è possibile determinare quali varianti sono presenti nel campione analizzato. Questo metodo consente di distinguere in modo affidabile tra portatori eterozigoti e omozigoti di mutazioni.

BAKENS MOLECOLARI Un altro metodo di rilevamento delle mutazioni, basato sull'effetto di estinzione della fluorescenza, è implementato nel metodo dei fari molecolari (Fig. 4.11). Un oligonucleotide è chiamato una boa, le cui estremità 3 'e 5' sono etichettate con due coloranti, uno dei quali agisce da quencher. In contrasto con i campioni di TaqMan, le boe sono più lunghe e contengono vicino alle estremità delle brevi parti complementari l'una dell'altra, che a temperatura ordinaria si ricoprono a vicenda per formare una struttura a forcina. In questo caso, i coloranti situati alle estremità dell'oligonucleotide si avvicinano l'un l'altro e la fluorescenza di un colorante viene attenuata da un altro. Nel mezzo della boa, la sequenza nucleotidica corrisponde alla regione del DNA studiata. Dopo la denaturazione per riscaldamento, che porta alla fusione della sezione della forcina, la miscela di DNA con boe viene raffreddata, il che rende possibile formare un duplex della boa con il DNA analizzato. A ulteriore raffreddamento, i prigionieri vengono riformati nelle boe libere e la fluorescenza diminuisce. Al contrario, nei beacon legati al DNA analizzato,

Fig. 4.11. Metodo dei beacon molecolari. P - colorante reporter, fluorescenza T - quencher

i coloranti rimangono distanti l'uno dall'altro e la loro fluorescenza rimane alta. L'ibridazione del DNA del test con secchi contenenti una sequenza nucleotidica normale o mutante nella parte centrale consente di determinare il genotipo del DNA del test.

IBRIDAZIONE A TUTTI SPECIFICI

Questo metodo si basa sull'ibridazione del DNA del test con oligonucleotidi omologhi al sito di mutazione e alla sequenza circostante. Questo metodo esiste in due forme. A volte un prodotto di PCR viene immobilizzato su una base solida e gli oligonucleotidi etichettati vengono aggiunti in soluzione. Le condizioni di lavaggio sono selezionate in modo tale da distruggere i duplex contenenti basi non appaiate. Di conseguenza, solo gli oligonucleotidi che sono al 100% complementari al DNA analizzato rimangono sulla matrice. Aggiungendo oligonucleotidi corrispondenti in sequenza alla variante normale o mutante, è possibile determinare quale nucleotide è presente nel DNA analizzato. Nella seconda variante di questo metodo, gli oligonucleotidi sono immobilizzati sulla matrice, con cui il prodotto PCR etichettato si ibrida.

Il vantaggio del metodo di ibridazione con gli oligonucleotidi è la possibilità della sua miniaturizzazione, quando un ampio insieme di oligonucleotidi viene immobilizzato su un microchip, che consente di rilevare simultaneamente molte mutazioni. La principale difficoltà di questo metodo è la necessità di una rigorosa selezione delle condizioni per l'ibridazione e il lavaggio del DNA incompletamente complementare. Non è chiaro quanto ampiamente questo metodo verrà utilizzato nella diagnostica del DNA pratico.

REAZIONE DI LIGASI TUTTA SPECIFICA Un metodo efficace per la rilevazione di sostituzioni a nucleotide singolo e riarrangiamenti brevi è la reazione alla ligasi (Fig. 4.12). Il DNA analizzato si ibrida con due oligonucleotidi, uno dei quali termina con un nucleotide, complementare al sito polimorfico, e il secondo direttamente adiacente ad esso. Dopo la fine dell'ibridazione, l'enzima DNA ligasi incrocia legami con gli oligonucleotidi con la formazione di un frammento più lungo, che è molto diverso dagli oligonucleotidi originali in mobilità

Fig. 4.12. Reazione ligasi allele specifica

con elettroforesi. Se gli oligonucleotidi non sono completamente complementari al frammento di DNA e dopo l'ibridazione si forma un nucleotide non appaiato nella regione polimorfa, la ligasi non reticola tali oligonucleotidi e non si forma un lungo frammento. Quindi, conducendo una reazione di ligasi con uno comune e uno di due campioni allele-specifici, si può genotipizzare un campione di DNA per un dato nucleotide.

In questo metodo, il prodotto della PCR è ibridato con un legame di oligonucleotidi sul lato b'del sito del polimorfismo (Figura 4.13). Dopo l'ibridazione, una miscela di DNA polimerasi e uno di quattro nucleotidi modificati vengono aggiunti alla miscela di reazione. In questa reazione, vengono usati dideossinucleotidi marcati con fluorescenza, in conseguenza del quale la DNA polimerasi può completare solo un nucleotide complementare a quello situato nella posizione analizzata. Pertanto, la reazione avverrà solo nel tubo, dove viene aggiunto il nucleotide, complementare a quello analizzato. In alcuni casi, tutti e quattro i nucleotidi sono presenti nella miscela di reazione, ma etichettati con coloranti diversi. L'analisi della fluorescenza a quattro lunghezze d'onda consente di determinare quale nucleotide è attivato e, di conseguenza, il nucleotide analizzato è complementare ad esso. Poiché questo metodo utilizza lo stesso principio del sequenziamento del DNA enzimatico, è spesso chiamato mini-sequenziamento.

Esistono altri metodi per determinare le mutazioni in base all'attività della DNA polimerasi. In uno di questi, chiamato pirosequenziamento, ogni fase dell'estensione della catena della DNA polimerasi viene registrata dalla formazione di pirofosfato, che viene monitorato utilizzando reazioni enzimatiche coniugate, dando luogo a un focolaio di chemiluminescenza in risposta alla formazione di pirofosfato (Figura 4.14). Questo metodo consente di sequenziare solo sezioni molto brevi del DNA, quindi il suo uso principale è quello di analizzare le mutazioni. Il nucleotide da analizzare è identificato dall'aggiunta di quale dei quattro nucleotidi (i nucleotidi convenzionali sono usati in questo metodo) ha provocato un focolaio di chemiluminescenza.

Fig. 4.13. minisequencing

Fig. 4.14. Il principio del sequenziamento del DNA

DIAGNOSI DI MUTAZIONE Β DIAGNOSTICA Se utilizzati correttamente, i metodi di rilevamento determinano la presenza o l'assenza di mutazioni con sensibilità e specificità molto elevate, che consente di utilizzare le informazioni ottenute con questi metodi per prendere decisioni molto importanti, come la necessità di aborto durante la diagnosi prenatale.

Esistono due metodi per la diagnosi prenatale. L'amniocentesi consiste nella selezione di circa 10 ml di liquido amniotico attraverso la parete addominale (figura 4.15). Termine ottimale

Fig. 4.15. amniocentesi

realizzazione - la 16a settimana di gravidanza. Le cellule fetali vengono isolate dal liquido mediante centrifugazione e immediatamente analizzate mediante PCR o immesse in coltura. Le cellule in cultura si dividono, e dopo un po 'di tempo sono sufficienti per eseguire l'analisi cromosomica e in seguito - biochimica. Il secondo metodo, la biopsia del villi coriali, è possibile nelle prime fasi della gravidanza, alla settimana 10-12 (Fig. 4.16). Questa procedura consiste in una biopsia transaddominale o transcervicale dei villi corionici. Le cellule corioniche possono essere coltivate o analizzate immediatamente se c'è abbastanza materiale per l'analisi del DNA. Se vengono rilevate anomalie cromosomiche o mutazioni, la gravidanza può essere interrotta dai genitori.

Condurre diagnosi prenatale delle mutazioni ha senso quando esiste un metodo affidabile per rilevare la mutazione che è presente in una determinata famiglia. In alcuni casi può essere determinato

Fig. 4.16. Biopsia corionica

se il feto ereditasse una malattia ereditaria, non conoscendo la posizione esatta della mutazione, ma facendo affidamento sull'analisi del legame genetico della malattia in famiglia. Tuttavia, questo non è sempre possibile, perché per l'analisi del collegamento sono richiesti campioni di DNA di parenti ammalati e un numero elevato di membri sani della famiglia.

4.5.2. CARATTERISTICHE DELL'APPLICAZIONE DIAGNOSTICA DEL DNA

Il valore diagnostico massimo dei test genetici è osservato nei casi in cui vi è un'alta correlazione tra la presenza di un difetto genetico e la probabilità di sviluppare una patologia, cioè per malattie con penetranza elevata.

Tali malattie subiscono una pressione costante della selezione naturale, a seguito della quale la loro frequenza nella popolazione generale è generalmente ridotta. A questo proposito, la maggior parte dei test genetici applicati sono associati alla diagnosi di forme rare di malattie. Anche le forme più comuni di malattie monogeniche umane, descritte di seguito, sono clinicamente manifestate non più spesso che in una persona su diverse centinaia.

Malattie umane comuni come ipertensione, diabete, malattie cardiovascolari, anche se dipendenti da fattori genetici, hanno bassa penetranza, struttura genetica complessa, variabile e scarsamente studiata, quindi, nonostante l'ovvia necessità di cercare una predisposizione genetica alle malattie comuni, i risultati di tali la ricerca nella pratica è molto limitata.

FATTORI DI EFFICIENZA Il rapporto tra l'informatività dei risultati della diagnostica del DNA e il costo della sua attuazione è in gran parte determinato dalla complessità genetica della malattia. Gli esempi includono l'emocromatosi, in cui due mutazioni causano quasi tutti i casi clinici tra la popolazione bianca e l'ipercolesterolemia familiare, che può essere causata da più di 800 mutazioni nel gene del recettore LDL, nessuno dei quali è più comune che nell'1% dei pazienti con ipercolesterolemia familiare. La maggior parte delle malattie ereditarie sono intermedie in questo intervallo, avvicinandosi all'ipercolesterolemia familiare, quando il costo della diagnostica del DNA può limitare la sua attuazione.

In determinate condizioni, la complessità della diagnosi e, di conseguenza, il suo costo possono essere ridotti. Questo è possibile nelle popolazioni in cui la struttura genetica di una malattia è più semplice rispetto ad altre popolazioni. Questo effetto è più pronunciato nelle popolazioni con il cosiddetto effetto fondatore. Questo termine genetico significa che una parte significativa della popolazione ha ereditato una certa mutazione da uno dei suoi antenati fondatori. A causa di questo evento puramente casuale in questa popolazione, la maggior parte dei casi di questa malattia sono causati da questa mutazione. Un tipico esempio relativo ai test genetici è la popolazione di afrikaner, persone dell'Africa meridionale di origine nordeuropea. Gli afrikaner moderni sono discendenti di un piccolo numero di famiglie olandesi emigrate in Africa nei secoli XVII-XVIII. Tra gli afrikaner, l'ipercolesterolemia familiare, che porta allo sviluppo precoce della malattia coronarica, è molte volte più comune che nella popolazione europea o americana. Inoltre, la stragrande maggioranza (> 95%) dei casi di ipercolesterolemia familiare nella popolazione bianca sudafricana è dovuta alla presenza di una delle sole tre mutazioni nel recettore LDL. Tale omogeneità genetica contrasta nettamente con la struttura genetica dell'ipercolesterolemia familiare in altri paesi, dove sono descritte centinaia di mutazioni, nessuna delle quali è più comune che nell'1-2% dei pazienti. Apparentemente, diverse famiglie di immigrati (almeno tre) avevano mutazioni, ora chiamate afrikanerskimi, che divenne la principale causa di ipercolesterolemia familiare nei loro discendenti. Dal punto di vista della medicina pratica, il test genetico molecolare dei bianchi in Sudafrica per la presenza di ipercolesterolemia familiare è un approccio abbastanza efficace e relativamente economico che consente la diagnosi presintomatica di questa malattia. A differenza del Sudafrica, altri paesi richiedono un arsenale molto più costoso di metodi molecolari per fare una diagnosi del genere.

Per altre malattie ereditarie, c'è anche una differenza nella frequenza delle mutazioni tra le popolazioni. Ad esempio, mutazione missenso cis282

La gomma del gene HFE, che porta allo sviluppo dell'emocromatosi, è abbastanza comune nelle popolazioni europee, dove la frequenza dei suoi portatori è del 10-15%. Al contrario, nelle popolazioni aborigene africane, asiatiche e australiane

Questa mutazione è molto rara. La mutazione Cis è supposta282-La gomma è nata in Europa circa 2000 anni fa.

Oltre all'effetto del fondatore, il secondo meccanismo biologico che semplifica la ricerca di mutazioni anche in una popolazione geneticamente aperta è la presenza di punti di mutazione caldi nei geni. È dimostrato che la probabilità di insorgenza di mutazioni differisce in aree del genoma con diverso contenuto di nucleotidi GC. È anche nota la sequenza in cui viene interrotta la DNA polimerasi a; in tali regioni, le delezioni sporadiche si trovano spesso in una varietà di geni. A causa di questi fattori, le mutazioni non sono distribuite uniformemente lungo la lunghezza del gene, ma sono concentrate in certe aree, il che semplifica la loro ricerca.

Pertanto, per un'efficace diagnostica del DNA, sono necessarie informazioni sulle mutazioni più frequenti che portano allo sviluppo di questa malattia nella popolazione a cui appartiene il paziente.

FATTORI DI VALORE DIAGNOSTICO

In un certo numero di disturbi metabolici ereditari, la presenza della malattia può essere sospettata durante l'analisi biochimica. Ad esempio, nei pazienti con ipercolesterolemia familiare, il livello di colesterolo LDL è solitamente elevato e nell'emocromatosi la saturazione della transferrina con il ferro aumenta. I parametri biochimici sono soggetti a variabilità in ogni individuo. Di conseguenza, gli individui, ad esempio, con livelli elevati di colesterolo LDL, si raccomanda di ripetere i test con un intervallo di 3 mesi per assicurarsi che la deviazione metabolica rilevata sia affidabile. In alcuni casi, gli indicatori biochimici si trovano nella cosiddetta zona grigia, che complica ulteriormente la diagnosi. Questo è dove la diagnostica del DNA può aiutare. La presenza di mutazione mostra la predisposizione media per tutta la vita a spostare questo parametro biochimico sul lato patologico, per così dire, prontezza patologica. In contrasto con il fenotipo biochimico, il genotipo non è soggetto a variazioni individuali e di popolazione caratteristiche dei parametri biochimici. Pertanto, la diagnostica del DNA consente di confermare la diagnosi biochimica con un metodo indipendente, nonché di escludere la presenza di altre cause di questo disturbo biochimico. Ovviamente, la massima informatività della diagnosi del DNA dei disordini metabolici ereditari viene raggiunta quando è combinata con i metodi biochimici classici.

Quando si discute della specificità e della sensibilità dei metodi di diagnostica del DNA, si dovrebbe prima determinare cosa è in gioco - la determinazione di una specifica mutazione o la ricerca di una malattia genetica sconosciuta in un paziente. Nel caso di una mutazione specifica, per la quale sono stati sviluppati metodi di rilevamento affidabili, la sensibilità e la specificità del rilevamento sono vicine al 100%. Per determinare il valore diagnostico del test genetico molecolare totale, è necessario tenere conto della sensibilità del rilevamento delle mutazioni in combinazione con la loro penetranza.

Il valore diagnostico positivo del test è in gran parte determinato dalla penetranza delle mutazioni. Ad esempio, il rilevamento della trisomia sul cromosoma 21, o mutazioni specifiche per la distrofia muscolare di Duchenne o la malattia di Huntington, suggerisce che questi individui con una probabilità prossima al 100% hanno o svilupperanno ulteriormente la corrispondente sindrome clinica. Tuttavia, un valore diagnostico così alto e positivo non è tipico per tutti i test genetici. Con mutazioni a bassa penetranza, ad esempio, nei portatori di mutazioni dell'emocromatosi, la probabilità di sviluppare manifestazioni cliniche non supera il pochi percento. In questi casi, l'individuazione di un difetto indica solo una predisposizione allo sviluppo di questa malattia, che dipende fortemente dalla presenza di ulteriori fattori ereditari e fattori ambientali.

Più semplice e più studiata è la struttura genetica di questa malattia, più è facile rilevare la mutazione e maggiore è la sensibilità del test. Sfortunatamente, la stragrande maggioranza delle malattie genetiche sono causate da una vasta gamma di mutazioni, spesso localizzate in geni diversi. In combinazione con le limitate capacità dei moderni metodi molecolari, questo riduce la sensibilità dei test genetici molecolari. Ad esempio, attualmente, anche nei migliori laboratori di genetica molecolare che lavorano con pazienti con ipercolesterolemia familiare, le mutazioni possono essere rilevate solo nella metà dei pazienti con una diagnosi clinica verificata. Un altro esempio è la miodistrofia di Duchenne. In questo caso, la malattia di delezione nel gene della distrofina può essere rilevata solo nel 70% dei casi e il resto dei pazienti ha bisogno di un'ulteriore analisi istologica della biopsia muscolare. Nei casi in cui il test non è in grado di rilevare tutti i cambiamenti genetici che portano alla malattia, il suo potere predittivo negativo è basso.

In certe situazioni, il potere predittivo negativo dei test del DNA può essere molto alto. Stiamo parlando di diagnostica prenatale e presintomatica nei casi in cui sono note mutazioni patogene che sono presenti nei genitori. In tale situazione, l'elevata accuratezza dei metodi molecolari consente con sufficiente affidabilità di mostrare non solo la presenza, ma anche l'assenza di mutazioni genitoriali nel feto o nel bambino.

Riassumendo, possiamo dire che la maggior parte dei test genetici molecolari ha un significativo potere predittivo positivo, il che rende consigliabile utilizzarli in clinica, specialmente in caso di penetranza e patogenicità delle mutazioni. Al contrario, il potere predittivo negativo della maggior parte dei test molecolari è piccolo, tranne quando è noto quali mutazioni erano presenti nei genitori.

4.5.3. ESEMPI DI UTILIZZO DELLA DIAGNOSTICA DEL DNA IN CLINICA

Come è noto, la genetica medica classica descrive malattie monogeniche ad alta penetrazione e clinicamente gravi. La frequenza di tali malattie di solito non supera 1 su 5000 abitanti. Circa un migliaio di malattie ereditarie monogeniche possono essere rilevate utilizzando l'analisi del DNA. L'elenco dei test e dei laboratori che li eseguono viene costantemente aggiornato su Internet (http://www.geneclinics.org). La maggior parte della diagnostica del DNA viene ora utilizzata nella consulenza genetica e nella diagnosi prenatale per prevenire la nascita di bambini con patologia.

Tuttavia, oltre ai classici casi monogenici, nella clinica vengono spesso riscontrate malattie ereditarie, che sono caratterizzate da penetranza relativamente bassa e un decorso relativamente lieve. Tradizionalmente, sono stati attribuiti a monogenico, tuttavia, i dati accumulati recentemente indicano una natura più oligogenica di queste malattie.

Dettagliatamente in seguito oligogene numerose malattie umane recensione, come emocromatosi, trombofilia ereditaria, ipercolesterolemia familiare, fibrosi cistica e cardiomiopatia ipertrofica. I portatori eterozigoti di mutazioni che portano a queste malattie si verificano nella popolazione con una frequenza di 1 su 500 a 1 su 20 persone. A causa della elevata frequenza di popolazione della malattia in questo gruppo, un significativo

contributo totale alla patologia umana, probabilmente superiore al contributo delle malattie ereditarie rare. Per tutte queste malattie test DNA consente la diagnosi presintomatico, e per l'emocromatosi, trombofilia e ipercolesterolemia - e successiva prevenzione farmacologica e cambiando stile di vita.

Questo è uno dei più comuni disturbi metabolici genetici chiamati errori metabolici congeniti: l'emocromatosi (GC) si verifica in 1 su 200-300 persone nel Nord Europa.

La classica triade - diabete, cirrosi e pigmentazione della pelle ("diabete di bronzo") - fu descritta già nel 1865 e nel 1935 fu dimostrata la natura familiare di questa malattia. La base delle manifestazioni cliniche di GC è un difetto biochimico: eccessivo accumulo di ferro nelle cellule parenchimali del fegato, del pancreas, del cuore e della ghiandola pituitaria anteriore. Per prevenire lo sviluppo di manifestazioni cliniche, è possibile utilizzare un modo molto semplice e allo stesso tempo efficace - flebotomia preventiva. Il fenotipo GC intermedio è un elevato livello di ferro nel plasma e nel fegato, che viene valutato mediante vari test biochimici, come la saturazione della transferrina con ferro, la concentrazione di ferritina e il contenuto di ferro nel fegato.

Le manifestazioni cliniche di GC sono molto diverse. Una delle manifestazioni più frequenti è il danno cronico del parenchima epatico. Una caratteristica caratteristica è un miglioramento generale o locale della pigmentazione della pelle. Il 30-60% dei pazienti con malattia avanzata ha il diabete. Nei primi stadi GC manifesta con sintomi aspecifici come letargia, epatomegalia, artropatia, cardiomiopatia, diabete, iperpigmentazione cutanea, o ipogonadismo. Le manifestazioni cliniche dipendono da fattori genetici ed esterni, come il contenuto di ferro nella dieta, la donazione di sangue e la perdita di sangue fisiologica nelle donne durante le mestruazioni.

Nel 1996 è stato identificato un gene responsabile della forma più comune di GC, chiamata HFE. Questo gene codifica per una proteina transmembrana costituita da un breve dominio citoplasmatico, una regione transmembrana e tre domini extracellulari che interagiscono con β2-microglobulina sulla superficie cellulare. La proteina HFE si lega sulla superficie dell'enterocita al recettore della transferrina e diminuisce l'affinità per il trasporto di transferrina

ferro. In assenza di HFE funzionalmente attiva, il legame e la successiva endocitosi dell'aumento della transferrina, che porta all'accumulo di ferro all'interno della cellula, dove viene immagazzinato come un complesso con ferritina. Tra i pazienti di origine celtica con GC clinicamente grave, circa il 90% è omozigote per la mutazione Cis282-Pneumatico nel gene HFE e la maggior parte dei restanti ha una combinazione di Cys282-Tyr e un'altra mutazione - GiSos-Asp. Come risultato della mutazione Cis282-Un Tyr interrompe la formazione di un legame disolfuro in uno dei domini extracellulari della proteina HFE, la sua conformazione è disturbata e la proteina rimane dopo la sintesi nel reticolo endoplasmatico. Di conseguenza, la proteina cessa di essere espressa sulla superficie cellulare, il che porta ad una maggiore cattura di ferro, che è inadeguata ai bisogni dell'organismo. Nella maggior parte delle popolazioni caucasoidali, la frequenza dei portatori eterozigoti dell'allele Cis282-La gamma è di circa il 10%, e per i baschi e gli irlandesi di origine celtica, la frequenza di questo polimorfismo può raggiungere il 30%. A differenza degli europei, questa mutazione non si trova quasi mai nei mongoloidi e nei negri. La mutazione Cis è supposta282-La gomma originò circa 2000 anni fa nella popolazione celtica e si diffuse in tutta Europa a causa della migrazione della popolazione, cioè il fondatore causò un'alta frequenza di questa mutazione.

Ci sono altre malattie con un quadro clinico simile a un classico GC di famiglia (anche classificato come GC di tipo 1), ma con un'origine diversa. GC giovanile (tipo 2), così come il tipo 1 GC, è ereditato in modo autosomico recessivo ed è causato da mutazioni in un gene sconosciuto. Il GC di tipo 3 è anche una malattia recessiva ed è associato a una mutazione nel recettore della transferrina. I GC del 4 ° e 5 ° tipo sono ereditati prevalentemente e sono causati da mutazioni nei geni della ferroportina, trasportando ferro nell'intestino e ferritina, rispettivamente. Tutte queste forme sono molto rare e oggi la loro definizione non ha un ruolo pratico.

Il gene Tire nel gene HFE è caratterizzato da un'alta penetria rispetto al fenotipo intermedio, cioè il segno biochimico di un eccesso di ferro nel corpo. Il 95% degli uomini sopra i 40 anni che sono omozigoti per questa mutazione ha un eccesso di ferro e vi sono segni e sintomi clinici. Le donne in premenopausa hanno un rischio più basso a causa della perdita di sangue durante

mestruazioni. L'effetto fenotipico della mutazione GiSos-Asp è meno pronunciato. La fibrosi o la cirrosi del fegato vengono rilevate analizzando una biopsia nel 4-25% dei portatori omozigoti dell'allele Cis282

Poligono di tiro Inoltre, l'allele Cis282-Tir predispone allo sviluppo del carcinoma epatocellulare. Negli uomini con GC e cirrosi, il rischio relativo di sviluppare carcinoma epatocellulare è 200 volte superiore.

PROVE PER I MEDIA

La presenza dei suddetti sintomi è un'indicazione per i test genetici su GC. Tuttavia, la diagnosi viene fatta durante il quadro clinico espanso, quando è troppo tardi per effettuare la prevenzione del difetto primario. A questo proposito, molti ricercatori sostengono la necessità di sottoporre a screening la popolazione per la presenza di GC. Questa malattia soddisfa molti dei requisiti per le malattie sottoposte a screening, vale a dire si verifica abbastanza spesso, ha una fase latente che precede le manifestazioni cliniche, è facilmente diagnosticata con metodi biochimici e genetici e può essere prevenuta con l'aiuto di un trattamento efficace ed economico.

Tuttavia, per ora lo screening di massa è considerato prematuro a causa di ambiguità, principalmente legate alla penetranza GC. Sicuramente è opportuno test di parenti di pazienti con GC, che dovrebbe misurare il livello di saturazione di ferro della transferrina, contenuti ferritina e marcatori biochimici di disfunzione epatica, nonché per determinare la presenza di mutazioni nel gene HFE in posizione 282 e 63.

Da un punto di vista tecnico, la rilevazione di queste mutazioni non è difficile. Vengono comunemente utilizzate analisi di restrizione o varie forme di amplificazione o ibridazione allele-specifica.

4.5.3.2. Trombofilia ereditaria

La trombofilia è una tendenza a sviluppare trombosi associata a disordini della coagulazione del sangue congeniti e acquisiti e fibrinolisi. La trombofilia si manifesta il più delle volte sotto forma di trombosi venosa e tromboembolismo, che si verificano con una frequenza di circa 1 su 1000 abitanti all'anno.

Esistono forme familiari di trombofilia, descritte già negli anni '50. Le prime cause identificate di trombofilia ereditaria (NTF) erano carenza di antitrombina III,

Proteina C e il suo cofattore proteina S. Più recentemente state identificate altre due forme NTF - mutazione del fattore V della coagulazione che è resistente Fattore V alla proteina C attivata, e gene della protrombina mutazione G20210A, che aumenta il livello di protrombina in un plasma. Inoltre, iperomocisteinemia moderata, spesso associata comune polimorfismo nel gene MTHFR, è anche un fattore di rischio per la trombosi venosa.

COMPLICAZIONE TROMBOEMBOLICA La gravità delle manifestazioni cliniche di NTF varia notevolmente. Spesso procedono in una forma molto leggera e la loro presenza può essere determinata solo con metodi di laboratorio. Tuttavia, in molti casi, i portatori della mutazione sviluppano trombosi venosa profonda degli arti inferiori, embolia polmonare, tromboflebite superficiale, trombosi venosa e altri siti. Questi difetti ereditari di solito non sono associati al rischio di occlusione arteriosa. NTF predispongono alla trombosi soprattutto in giovane età: il 40% dei pazienti di età inferiore a 45 anni con TVP non provocato sono una forma di NTP. Nei pazienti più anziani o in presenza di fattori provocatori NTF osservato nel 30% dei casi di trombosi. Nei pazienti con una combinazione di difetti ereditari, il rischio di complicanze tromboemboliche è ulteriormente aumentato.

deficit ereditario di antitrombina III e le proteine ​​C e S si trova in totale meno di 1% della popolazione, ma in pazienti con tromboembolia venosa (TEV), si trova in quasi il 10% dei casi. Il rischio di TEV in questi pazienti è 5-8 volte superiore rispetto alla popolazione generale. Le cause di carenza di questi anticoagulante naturale può essere una diminuzione nella loro sintesi, o (più spesso) riduzione della attività funzionale della proteina mantenendo livelli normali. Difetti di sintesi proteica o funzionamento sono causati da centinaia di mutazioni diverse in questi geni.

La resistenza ereditaria alla proteina C attivata è la causa più comune di NTF. Più del 95% della resistenza è causata dalla mutazione missenso nel gene per il fattore V, doppiato Leiden, in cui arginina in posizione 506 è sostituita da glutammina. Da questo residuo amminoacidico si verifica nel normale scissione proteolitica del fattore V attivato proteina C. La proteina C è un anticoagulante naturale che attiva trombina trombomodulinovym

complesso su cellule endoteliali e distrugge i fattori Vun e viiiun, portando a fermare la formazione di trombi. Questo processo è significativamente accelerato in presenza della proteina S, che agisce come cofattore proteico C. Se c'è una sostituzione amminoacidica nel fattore Va Arg506-La proteina C gln attivata non può scomporla, il che porta alla conservazione dell'attività del fattore V e all'aumento della formazione di trombi (figura 4.17).

La mutazione di Leiden si verifica quasi esclusivamente tra i caucasici, in cui circa il 5% della popolazione è portatore. A causa dell'alta frequenza di questa forma genetica nella popolazione generale, tuttavia, si dovrebbe fare riferimento al polimorfismo

Fig. 4.17. Resistenza alla proteina C attivata, causata dalla mutazione di Leiden.

in letteratura, il nome della mutazione era fissato su di esso. Tra i pazienti con TEV, la frequenza di questa mutazione è più alta ed è di circa il 20%. Il rischio di TEV nei portatori della mutazione di Leiden dipende dalla dose del gene: negli eterozigoti, è aumentato 2-7 volte, e negli omozigoti - 40-80 volte. La probabilità totale di sviluppare tromboembolismo durante la vita dei portatori di questa mutazione è del 30%.

L'allele polimorfico G20210A nella regione 3'-non tradotta del gene della protrombina nella popolazione generale si verifica con una frequenza del 2%, ma tra i pazienti con TEV la percentuale di portatori di polimorfismo aumenta al 7%. Pertanto, la presenza del polimorfismo G20210A nel gene della protrombina aumenta il rischio di TEV di circa 3 volte. L'effetto patologico di questo polimorfismo è quello di aumentare l'attività della protrombina nel plasma. Il livello di protrombina negli omozigoti AA è 1,5 volte superiore a quello degli omozigoti nel normale allele GG, che contribuisce alla trombosi. Apparentemente, la mutazione G → A si riferisce al tipo di mutazioni con l'acquisizione di una funzione, poiché aumenta l'efficienza dell'elaborazione dell'estremità 3 dell'mRNA, che porta all'accumulo di mRNA e ad un aumento della sintesi della proteina della protrombina.

Un altro fattore predisponente per la trombosi è un aumento del livello di omocisteina, un amminoacido formatosi durante il metabolismo della metionina. Un moderato aumento dell'omocisteina aumenta il rischio di trombosi arteriosa e venosa. Il motivo dell'aumento può essere un'alimentazione anormale (mancanza di piridossina, cobalamina, folato) o fattori genetici, come il polimorfismo di Al.677

L'albero nel gene metilenetetraidrofolato reduttasi - un enzima che svolge un ruolo importante nel determinare il livello di omocisteina nel plasma. L'attività di questa variante dell'enzima è solo di circa 1/3 del normale. Circa il 10% dei caucasici sono portatori eterozigoti di questo polimorfismo. La frequenza di VTE in portatori isolati di questo polimorfismo non è diversa dalla norma, ma un numero di dati mostrano che il polimorfismo C677T contribuisce alla manifestazione di altre NTF.

BEROMENALITÀ E PATOLOGIA OSTETRICA Durante la gravidanza, il livello dei fattori di coagulazione dipendenti dalla vitamina K aumenta, il contenuto della proteina S diminuisce e la fibrinolisi viene inibita. Questi cambiamenti sono fisiologicamente fattibili, poiché mirano a ridurre la perdita di sangue durante il parto, ma aumentano anche la probabilità di TEV durante la gravidanza (2,5 volte) e specialmente nel periodo postpartum (20 volte).

In presenza di NTF, questa probabilità è ancora più elevata e può raggiungere 100 volte negli omozigoti per la mutazione di Leiden del fattore V. La maggioranza (fino al 60%) delle donne con TEV sviluppate durante la gravidanza ha una mutazione di Leiden.

Oltre al tromboembolismo venoso, le NTF contribuiscono allo sviluppo della patologia ostetrica. La violazione della completa circolazione placentare uterina a causa della trombosi può portare a una serie di complicazioni della gravidanza, come aborto, natalità nasale, distacco della placenta, preeclampsia e ritardo della crescita intrauterina. Numerosi studi hanno dimostrato un aumento dell'incidenza di NTF in pazienti con queste complicanze. Esistono anche prove del fatto che la presenza di una mutazione non solo nella madre, ma anche nel feto può aumentare ulteriormente il rischio di trombosi e infarto placentare, portando alla perdita del feto. Il rischio relativo di complicanze della gravidanza nei portatori eterozigoti della mutazione di Leiden o del polimorfismo del gene della protrombina G20210A secondo vari studi è aumentato in media di 2-3 volte.

L'accettazione dei contraccettivi orali contribuisce anche allo sviluppo di TEV. Questo effetto è amplificato nelle donne con NTF. Il rischio di sviluppare TEV nei portatori della mutazione di Leiden che assumono contraccettivi orali, secondo varie stime, aumenta di 20-65 volte. In presenza di protrombina G20210A, il rischio di TEV è leggermente inferiore, ma anche significativamente superiore al valore normale. Sulla base di queste osservazioni, si raccomanda di non usare contraccettivi orali per le donne con una carenza di anticoagulanti naturali, omozigoti per la mutazione di Leida e in presenza di difetti combinati.

La terapia ormonale sostitutiva dopo la menopausa è un altro stato iatrogeno con un aumento di 2-4 volte del rischio di TEV. In presenza di una mutazione di Leiden, il rischio relativo può aumentare di 15 volte e aumenta anche la frequenza di trombosi ripetuta. A questo proposito, i portatori di NTF che hanno avuto episodi di TEV, si raccomanda di non usare la terapia ormonale sostitutiva.

INDICAZIONI PER L'ANALISI GENETICA L'analisi della mutazione di Leiden e del polimorfismo della protrombina G20210A, così come la determinazione della carenza di antitrombina e proteine ​​C e S, è un metodo efficace per identificare individui con un aumentato rischio di condizioni trombotiche. La rilevazione di queste mutazioni consente ai portatori di effettuare una terapia anticoagulante profilattica.

A causa della bassa frequenza assoluta di TEV, lo screening di massa della popolazione per la presenza di NTF non è giustificato. È considerato più appropriato esaminare i seguenti gruppi di pazienti per la presenza di NTF:

• persone con TEV, indipendentemente dall'età e dalla gravità delle manifestazioni;

• donne con uno o più aborti spontanei in uno stadio avanzato o con due o più aborti spontanei;

• donne in gravidanza con ritardo della crescita intrauterina o distacco della placenta;

• parenti del primo grado di parentela del paziente con NTF nella storia;

• donne con una storia familiare di NTF prima di usare contraccettivi orali, terapia ormonale sostitutiva o gravidanza.

TEST DIAGNOSTICI I test ad alta priorità per la presenza di NTF includono:

• determinazione dell'attività antitrombinica (metodo amidolitico);

• determinazione dell'attività della proteina C (metodo coagulometrico o amidolitico);

• determinazione della concentrazione di proteina S (frazioni di antigene totale e libera);

• determinazione coagulometrica della resistenza alla proteina C attivata;

• determinazione della mutazione di Leiden del fattore V;

• determinazione del polimorfismo della protrombina G20210A;

• determinazione dei livelli plasmatici di omocisteina.

Come si può vedere dall'elenco precedente, la deficienza di antitrombina e proteine ​​C e S è determinata mediante metodi funzionali. Ciò è dovuto al fatto che questi difetti sono causati da un gran numero di mutazioni e per identificarle sono necessari grandi sforzi e costi, mentre le analisi funzionali sono semplici e affidabili.

L'analisi della mutazione di Leiden e del polimorfismo della protrombina è semplice e completa bene i test funzionali. Apparentemente, l'analisi del polimorfismo C677T nel gene metilen tetragide-rofolatreduttasi non ha un valore diagnostico separato e deve essere usata in combinazione con la determinazione biochimica della concentrazione plasmatica di omocisteina. L'uso di questa serie di test consente di rilevare un difetto ereditario dei fattori della coagulazione o un aumento dell'omocisteina in circa il 40% dei pazienti con TEV.

Il metodo più affidabile per identificare la mutazione di Leiden e la protrombina G20210A è l'analisi della restrizione, ma anche la PCR e l'ibridazione allele-specifiche sono ampiamente utilizzate.

4.5.3.3. Ipercolesterolemia familiare

L'ipercolesterolemia familiare (FHC) è apparentemente la più comune malattia umana autosomica dominante. La frequenza di FHD nella maggior parte delle popolazioni è 1 su 500. Nelle popolazioni con l'effetto del fondatore, le forme eterozigoti sono molto più comuni: 1 su 70 in afrikaner in Sudafrica e 1 su 200 in canadesi di origine francese. Per lo stesso motivo, la frequenza di FHD nei finlandesi, drusi e libanesi è aumentata.

Non tutti i casi di FHC sono diagnosticati clinicamente. Ad esempio, in Russia, meno dell'1% dei pazienti con FHCS ha effettuato una diagnosi clinica e la diagnosi più efficace (oltre il 40% dei portatori identificati) viene effettuata in Islanda a causa delle ridotte dimensioni della popolazione con un pronunciato effetto fondatore e una piccola variabilità di mutabilità.

Le principali caratteristiche diagnostiche di SGHS sono l'elevato colesterolo nel sangue, la presenza di xantomi tendinei in un paziente o parenti di primo grado e il modello dominante di ereditarietà di colesterolo elevato o cardiopatia ischemica.

Clinicamente, l'SGHS si manifesta con un aumento del rischio di aterosclerosi e delle sue complicanze. I meccanismi che collegano l'aumento di colesterolo con lo sviluppo della malattia coronarica non sono completamente compresi. Si presume che un alto livello di LDL ricco di colesterolo contribuisca alla loro penetrazione nella parete del vaso, dove si ossidano e inneschino una catena di reazioni cellulari che portano all'accumulo di lipidi e alla riorganizzazione locale della parete del vaso, risultando in una placca aterosclerotica. In caso di FHC, il rischio di morte per infarto del miocardio in giovane età - fino a 40 anni - aumenta di 100 volte. Negli uomini non trattati con FHD entro i 60 anni, la probabilità di CHD è di circa il 75%. Secondo alcune stime, solo la metà degli uomini con SGHS vive per avere 60 anni. L'età media di insorgenza di IHD è di 40-45 anni per gli uomini e per le donne è di 10 anni più vecchia. Pertanto, la malattia coronarica nei pazienti con FHD si sviluppa 10-20 anni prima della media della popolazione.

Le statine e altri farmaci ipolipemizzanti sono efficacemente usati per ridurre i livelli plasmatici di lipoproteina in SHHS.

I pazienti più gravi (di solito, questi sono casi omozigoti) vengono trattati rimuovendo l'LDL in eccesso mediante scambio plasmatico. A volte viene utilizzato un trapianto di fegato.

MECCANISMI BIOCHIMICI E GENETICI

Quando il colesterolo SGHS è aumentato a causa dell'aumento delle LDL plasmatiche. Questo disturbo metabolico è associato ad una diminuzione della clearance delle LDL da parte del fegato a seguito di una diminuzione dell'espressione o dell'attività dei recettori cellulari che media l'assorbimento delle particelle di LDL (recettori LDL). L'attività del recettore LDL in FHCS diminuisce su tutte le cellule che esprimono questo recettore, tuttavia, le conseguenze funzionali sono principalmente associate a un difetto nel recettore nel fegato, poiché una violazione della conversione del colesterolo negli acidi biliari porta ad una diminuzione della sua escrezione attraverso l'intestino. Anomalie biochimiche simili sono osservate con un cambiamento mutazionale nella proteina apoB-100, che è un ligando per il recettore LDL. Come risultato di questa mutazione, le particelle LDL non sono più riconosciute dal recettore LDL e si accumulano nel plasma.

Il gene del recettore LDL contiene 18 esoni che codificano i sei domini funzionali di questa proteina: un peptide segnale, un dominio di legame del ligando, un dominio omologo al predecessore del fattore di crescita epidermico, il sito di O-glicosilazione, i domini transmembrana e citoplasmatico. Tutte le mutazioni note nel gene LDLR sono raccolte nel database UMD-LDLR, che è accessibile via Internet. Il numero di voci in esso ha superato 800 e continua a crescere. Secondo il database UMD-LDLR, le sostituzioni di singoli nucleotidi rappresentano il 90% di tutte le mutazioni nel gene LDLR, la maggior parte di esse sono mutazioni missense e non senso. Il restante 10% sono principalmente macrotrasformazioni causate da una ricombinazione ineguale con più di 30 copie delle sequenze di Alu presenti in questo gene. Meno di 10 mutazioni sono state trovate nel promotore.

Sebbene l'SGHS sia una malattia monogenica, l'espressione fenotipica, vale a dire la gravità della IHD, varia notevolmente anche tra i pazienti portatori delle stesse mutazioni. Alcuni pazienti vivono per avere 80 anni o più, mentre altri muoiono per un attacco cardiaco a 20 anni. I fattori che influenzano le manifestazioni cliniche possono essere esterni, metabolici e genetici.

Tra i fattori ambientali, il fumo e le abitudini alimentari hanno un ruolo speciale. Il fumo è uno dei più forti predittori di mortalità per malattia coronarica in pazienti con FHD. Il ruolo della dieta nello sviluppo

FHCS è stato dimostrato confrontando i pazienti di origine cinese che vivono in Canada con portatori delle stesse mutazioni, ma vivendo in Cina.

Il cinese canadese ha un colesterolo LDL del 70% più alto che in Cina. Inoltre, 6 dei 16 eterozigoti che vivevano in Canada avevano xantomi e 4 avevano CHD. Nessuno dei 18 intervistati che vivevano in Cina aveva uno xantoma o una cardiopatia ischemica. Apparentemente, tali differenze nelle manifestazioni cliniche sono associate al diverso consumo di grassi insaturi. Questo esempio illustra vividamente l'effetto modificante di fattori esterni, come la dieta, sul fenotipo dello SHKS eterozigote.

Il decorso della malattia dipende fortemente dal tipo di mutazione che causa l'iperlipidemia. L'ipercolesterolemia più grave si sviluppa in presenza di mutazioni nulle, portando ad una completa assenza del recettore attivo, mentre le mutazioni con conservazione della sintesi parziale o dell'attività dei recettori LDL solitamente causano una malattia più lieve.

Esistono numerosi parametri biochimici che modificano lo sviluppo della malattia coronarica nei pazienti con SHHS. Questi fattori metabolici sono: colesterolo HDL, proteina C-reattiva e fibrinogeno. Alcuni di questi fattori, come il colesterolo HDL e la lipoproteina Lp (a), hanno una base genetica pronunciata. Altri fattori genetici comprovati o sospetti includono mutazioni nel gene della lipoproteina lipasi - isoforme dell'apolipoproteina E, varianti della proteina estere del colesterolo, polimorfismo della paraossonasi (polimorfismo enzimatico del perossido lipidico), un particolare genotipo metilenotetraidrofolato reduttasi (associato ad un aumento del livello di omocisteina). sistema, così come le proteine ​​che trasportano i trigliceridi microsomiali, che influenzano la secrezione di VLDL.

Quindi, geneticamente, le mutazioni del recettore LDL sono il fattore principale che determina lo sviluppo di FHC. Il contributo di altri geni è innegabile, tuttavia, a causa del numero relativamente piccolo di pazienti con mutazioni identificate dei recettori LDL, sono necessari ulteriori studi sui geni modificatori. Idealmente, la determinazione del genotipo del paziente da parte di questi geni aggiuntivi consentirà di determinare il grado di rischio di malattia coronarica e altre complicazioni nei portatori di una particolare mutazione nel recettore LDL o nel gene apoB-100.

Il livello individuale di colesterolo è soggetto a cambiamenti naturali, quindi non è possibile trarre conclusioni

sulla disponibilità di SGHS. Inoltre, il livello di colesterolo dipende dall'età, dal sesso e varia in diverse popolazioni. Il livello di colesterolo in FHCS spesso supera il livello medio nella popolazione generale, pertanto, in alcuni casi è impossibile fare una diagnosi basata solo sui risultati della misurazione del colesterolo plasmatico.

Attualmente, la rilevazione di mutazioni nel recettore LDL o nel gene apoB-100 è un criterio comune nella diagnosi di FHC. Una mutazione al 3500th nucleotide nel gene apoB-100 (difetto della famiglia di apoB) è la causa più comune di FHC nella maggior parte delle popolazioni. In Europa e nei paesi in cui vivono persone provenienti dall'Europa (Australia, Stati Uniti, Canada e Nuova Zelanda), questa mutazione è causata nel 3-5% dei pazienti con FHCS. Nei paesi con una complessa struttura genetica della malattia, le mutazioni possono essere trovate nel 30-50% dei pazienti con una diagnosi clinica di SGHS. Ciò è dovuto sia alla scarsa sensibilità dei metodi di screening, sia alla diagnosi errata stabilita sulla base del livello di colesterolo e delle manifestazioni cliniche. Esiste anche la possibilità dell'esistenza di geni aggiuntivi, oltre al LDLR e all'APOB, mutazioni in cui sono accompagnate da un quadro clinico simile.

In un certo numero di popolazioni, la diagnostica del DNA di SGHS è notevolmente semplificata a causa della presenza di un numero limitato di alleli mutanti.

Tuttavia, nella maggior parte delle popolazioni geneticamente aperte, a cui appartiene la Russia, nessuna singola mutazione nel gene del recettore LDL si trova più spesso che nell'1% dei pazienti con FHC, e solitamente molto meno spesso. A questo proposito, i metodi di screening per la ricerca di mutazione, come determinare il polimorfismo di conformazione del DNA a filamento singolo, seguito dalla conferma mediante sequenziamento, svolgono un ruolo importante nella diagnostica del DNA di FHCS.

4.5.3.4. Fibrosi cistica

La fibrosi cistica (CF) è una delle più comuni e allo stesso tempo gravi malattie recessive autosomiche nell'uomo. Tra gli europei, la frequenza portante è circa

Da 1 a 50 e le forme cliniche si verificano a seconda della regione con una frequenza da 1 a 2-3 mila persone.

La CF ha ricevuto il suo nome dalla natura dei cambiamenti microscopici osservati nel pancreas in tali pazienti. La malattia colpisce anche i polmoni, il fegato, l'intestino tenue e il sistema riproduttivo maschile. Il ruolo chiave nella patogenesi è giocato dall'eccessiva secrezione di muco dall'epitelio di questi organi, che porta all'ostruzione dei bronchi o dei dotti escretori del fegato e del pancreas. Nonostante il significativo miglioramento nel trattamento sintomatico, i pazienti con CF di solito non vivono più a lungo di 20-30 anni. La principale causa di morte è il danno ai polmoni causato da un blocco dei bronchi, che crea un ambiente favorevole per le infezioni secondarie. Le infezioni croniche e una reazione infiammatoria portano alla fibrosi del tessuto polmonare che, in combinazione con un'ostruzione delle vie respiratorie, può causare insufficienza respiratoria. Nel 65% dei pazienti, il blocco dei dotti pancreatici previene la secrezione di enzimi digestivi nell'intestino, che porta a disturbi digestivi. Allo stesso modo, una violazione della secrezione della bile da parte del fegato, osservata nel 5% dei pazienti. Oltre a queste manifestazioni, il 10% dei neonati sviluppa un'ostruzione dell'intestino tenue, che richiede un intervento chirurgico. Inoltre, il 95% degli uomini con FC ha infertilità. Una caratteristica della CF, che è ampiamente utilizzata per la sua diagnosi, è l'aumento della salinità del sudore associato a un riassorbimento C1 compromesso

epitelio che riveste i dotti delle ghiandole sudoripare.

La KF è causata da mutazioni nella proteina codificata dal gene CFTR (regolatore di conduttanza transmembrana della fibrosi cistica). Questo gene consiste di 27 esoni e codifica una proteina con una massa molecolare di 168 kDa, che contiene due domini transmembrana, due domini intracellulari di legame al nucleotide e un dominio regolatorio. Questa proteina è un canale per gli ioni C1. Questo canale è attivato dalla protein chinasi cAMP-dipendente, che fosforila il dominio regolatorio. Uscita C1 - dalla cellula inizia una catena di reazioni che portano alla chiusura dei canali Na + e migliorare la produzione di secrezione di muco.

La causa più comune di fibrosi cistica è una delezione di tre nucleotidi nel 508 ° codone, portando a una perdita di fenilalanina. La frequenza di questa mutazione nei pazienti con FC varia dal 50% in Europa centrale a quasi il 90% in Nord. Come risultato di questa mutazione, il normale trattamento della proteina viene interrotto e, dopo la sintesi, non viene trasportato nella membrana plasmatica, ma viene trattenuto nel reticolo endoplasmatico e degradato. Tuttavia, ci sono un gran numero

altre mutazioni che danneggiano questa proteina; il loro numero si avvicina a 1000. Queste mutazioni più rare possono avere un effetto diverso sul canale del cloruro, ad esempio, ridurre parzialmente o completamente la sintesi proteica, interrompere il suo trasporto intracellulare o ridurre l'attività funzionale del canale. Alcune di queste mutazioni causano solo una diminuzione parziale della sintesi o dell'attività del canale, che può portare a varie manifestazioni funzionali. In quei casi in cui si conserva meno del 3% dell'attività, si sviluppa una grave fibrosi cistica accompagnata da una lesione del pancreas. Se si risparmia il 3-8% dell'attività colpisce i polmoni e il pancreas è normale. Se l'attività del canale C1 è dell'8-12%, si osservano forme lievi, come l'azoospermia negli uomini. Tuttavia, una relazione così semplice non è sempre osservata. Prevedere il decorso della malattia è possibile solo se esiste omozigosi per la delezione di fenilalanina-508 o la presenza simultanea di questa delezione e della mutazione G551D. In presenza di queste mutazioni, la malattia procede in una forma classica severa con una lesione del pancreas. Nella maggior parte degli altri casi, la relazione tra il tipo di mutazione e la manifestazione della malattia è difficile da prevedere. Vi è una crescente evidenza che la CF sia una malattia oligogenica e le sue manifestazioni fenotipiche dipendono non solo dalla natura della mutazione, ma anche dall'insieme di geni modificatori presenti nel paziente.

La FC può quasi sempre essere diagnosticata allo stadio prenatale utilizzando l'analisi del DNA da villi corionici, sia determinando direttamente le mutazioni, sia utilizzando l'analisi del linkage usando marcatori intragenici polimorfici nei casi in cui le mutazioni in un bambino malato sono sconosciute. La questione dello screening della popolazione per la presenza di FC è attualmente in fase di studio. Le informazioni accumulate sulla struttura genetica della CF ci hanno permesso di selezionare 30 mutazioni da quasi 1000 note, che, tuttavia, spiegano il 90% dei casi di FC in diverse regioni d'Europa e negli Stati Uniti. Tecnicamente, la diagnostica del DNA dei CF è abbastanza ben sviluppata e vengono prodotti numerosi kit commerciali per la sua implementazione.

4.5.3.5. Cardiomiopatia ipertrofica

La cardiomiopatia ipertrofica (HCM) è una delle più comuni malattie umane con una pronunciata predisposizione genetica. Si presenta con una frequenza di 1 su 500, che è significativamente più alta della frequenza di un'altra forma familiare di cardiomiopatia - dilatata (1 su 2500). HCM è ereditato

su tipo autosomico dominante ed è caratterizzato da penetranza fino al 75%. Clinicamente, la malattia si manifesta sotto forma di ipertrofia ventricolare sinistra e / o destra e un aumento delle dimensioni atriali. L'ipertrofia è solitamente asimmetrica e colpisce il setto interventricolare. Istologicamente, ipertrofia e disposizione irregolare dei cardiomiociti, così come la fibrosi interstiziale, sono osservati nel muscolo del cuore. La malattia porta ad aritmie e morte improvvisa, oltre a scompenso cardiaco.

La causa della malattia a livello molecolare è una disfunzione delle proteine ​​che compongono il sarcomero, quindi l'hcmp è talvolta chiamata malattia del sarcomero. L'ipertrofia è una risposta miocardica compensativa a una diminuzione della contrattilità. Attualmente sono stati identificati 11 geni, mutazioni in cui è stato condotto l'hcmp (Tabella 4.11).

Le mutazioni delle proteine ​​sarcomeriche hanno un effetto diverso sulla funzione contrattile dei cardiomiociti. Di conseguenza, le mutazioni missenso spesso formano proteine ​​stabili, ma inattive, che vengono inserite nel sarcomero e ne interrompono la funzione, ad es. avere un effetto negativo dominante Al contrario, mutazioni

Tabella 4.11. Mutazioni che portano alla cardiomiopatia ipertrofica

con uno spostamento nell'inquadratura, determinano la formazione di proteine ​​inattive accorciate, che sono soggette a degradazione accelerata. In entrambi i casi, l'attività contrattile diminuisce e si sviluppa una reazione ipertrofica compensatoria.

Il tipo di mutazione può influenzare la gravità della malattia. Ad esempio, un alto rischio di morte cardiaca improvvisa è associato a mutazioni nel gene MYH7 Arg4 once-Gln, Arg45z-Cis e arg72z-Gly. Al contrario, la mutazione di Gly25b-Glu, Val606-Met e Lei908- L'albero non è associato ad un aumentato rischio di aritmie. Le mutazioni nel gene MYBPC3 sono solitamente associate a lieve ipertrofia nei pazienti giovani, insorgenza tardiva della malattia e prognosi relativamente favorevole. Pertanto, la conoscenza del tipo di mutazione non solo conferma la diagnosi di hcmp, ma in alcuni casi aiuta a determinare la prognosi.

A causa della significativa eterogeneità genetica, la diagnosi molecolare di hcmp presenta una certa complessità. A causa della diversità delle mutazioni, i metodi di screening come l'analisi del polimorfismo della conformazione del DNA a filamento singolo, l'elettroforesi in un gradiente denaturante e anche la denaturazione dell'HPLC sono principalmente utilizzati per la ricerca di questa malattia. La ricerca di mutazioni viene effettuata principalmente nel gene della catena pesante β-miosina, così come nei geni della troponina cardiaca T e della proteina C legante la miosina cardiaca.