Principio. Conteggio dei leucociti durante la microscopia in un certo numero di quadrati della camera di conteggio e il calcolo del loro numero in 1 litro di sangue, tenendo conto della diluizione del sangue e del volume della camera di conteggio.
Reagente: soluzione al 3-5% di acido acetico, colorato per i nuclei di colorazione dei leucociti con alcune gocce di soluzione di blu di metilene. La soluzione ha un colore blu, può essere conservata a lungo.
Il corso della determinazione. In una provetta asciutta versare 0,4 ml di soluzione di acido acetico. 0,02 ml di sangue vengono prelevati da un dito (è possibile utilizzare sangue venoso stabilizzato anticoagulante). Pulire la punta della pipetta, quindi soffiare il sangue da esso sul fondo del tubo, mescolare, ricomporre e soffiare la miscela di sangue e reagente (pipettaggio). Etichettare il tubo e lasciarlo fino al conteggio. Si consiglia di conservare una miscela di sangue con una soluzione di acido acetico non più di 2-4 ore.
Il sangue diluito in una provetta con acido acetico, mescolare accuratamente e riempirlo con una camera di conteggio. La camera piena viene lasciata in posizione orizzontale per 1 minuto per sedimentare i globuli bianchi. Senza cambiare la posizione orizzontale della fotocamera, la posizionano sul tavolo del microscopio e con un basso ingrandimento (oculare 10 ×, obiettivo 8 ×) contano i globuli bianchi in 100 quadrati grandi, che corrispondono a 1600 piccoli.
Per una maggiore precisione, i leucociti vengono contati attraverso la griglia in grandi quadrati, non divisi in piccoli quadrati e strisce, a partire dall'angolo in alto a sinistra della griglia. Per un contrasto migliore, scurire il campo visivo, far cadere il condensatore e chiudere l'apertura. Le celle situate all'interno del quadrato e situate su due linee qualsiasi vengono contate per non contare due volte la stessa cella.
Il calcolo del numero di leucociti viene effettuato secondo la formula:
dove X è il numero di leucociti in 1 ml di sangue; e - il numero di leucociti in 100 quadrati grandi; 20 - diluizione del sangue; 100 è il numero di grandi quadrati; 250 è il fattore di conversione per 1 μl, poiché il volume di un quadrato grande è 1/250 μl (il lato del quadrato è 1/5 mm, l'altezza è 1/10 mm).
In pratica, per calcolare il numero di leucociti in 1 ml di sangue, il loro numero in 100 quadrati grandi viene moltiplicato per 50, e in 1 litro - il valore risultante viene moltiplicato per 106.
Nota. Quando si contano i leucociti, un errore è inevitabile nel 6-8% dei casi.
- Con un gran numero di normociti nel sangue periferico, sono contati nel numero di leucociti (sia leucociti che normociti - cellule nucleate). Per stabilire correttamente il numero di leucociti, dal numero totale di cellule di sangue nucleate è necessario sottrarre il numero di normociti.
- Gli errori rimanenti sono simili a quelli che si presentano quando si calcola il numero di globuli rossi nella camera di conteggio.
Conta dei leucociti
Per raccogliere il sangue nel miscelatore leucocitario al marchio 0,5. Aggiungere immediatamente al sangue una soluzione diluita al 3% di acido acetico per marcare 11. Miscelare a fondo il contenuto del capillare e riempire con esso la camera di Goryaev. Il conteggio viene effettuato in almeno 100 grandi quadrati. Queste sono grandi linee sfoderate, raggruppate in quattro nella griglia della fotocamera Goryaev. Calcola il numero di leucociti in 1 l di sangue con la formula:
L = N x 4000 x 20 x 10 6
dove: N è il numero di leucociti in cento quadrati di grandi dimensioni; 4000 è un moltiplicatore che riduce il volume di un piccolo quadrato al volume di 1 ml di sangue; 20 - correzione per il grado di diluizione del sangue; 1600 - il numero di leucociti in piccoli quadrati; 10 6 - il numero di microliti in 1 l.
Raccomandazioni per la registrazione
In conclusione, confronta i risultati ottenuti con i valori normali.
Lab № 7.3
Determinazione della quantità di emoglobina nel sangue
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Conteggio dei globuli bianchi
Leucocitosi può essere assoluta (vera) e relativa (redistributiva).
Leucocitosi assoluta è osservata nei processi infiammatori acuti, necrosi dei tessuti, infezioni batteriche acute (ad eccezione della febbre tifoide, brucellosi, tularemia, ecc.), Condizioni allergiche, tumori maligni (con distruzione tissutale), ferite alla testa e emorragie cerebrali, diabete. coma uremico, shock, perdita acuta di sangue, come reazione primaria - con malattia da radiazioni. Un aumento significativo del numero di leucociti si verifica con la leucemia.
Relativo (redistributivo) è una conseguenza della ricezione di leucociti nel flusso sanguigno dagli organi che servono per il suo deposito. Si manifesta dopo aver mangiato (leucocitosi alimentare), bagni caldi e freddi, forti emozioni (leucocitosi vegetovascolare), intenso lavoro muscolare (leucocitosi miogenica), ecc.
Leucopenia. La leucopenia è considerata un indicatore di inibizione della capacità funzionale del midollo osseo a seguito di esposizione a sostanze tossiche (arsenico, benzene, ecc.), Alcuni farmaci (sulfanilamidi, cloramfenicolo, butadione, immuno, ciclofosfamide, ecc.), Virus (influenza, epatite virale, morbillo, ecc.), microbi (tifo, brucellosi, ecc.), radiazioni ionizzanti, raggi X e ipersplenismo (aumento della milza).
Leucocitosi e leucopenia sono raramente caratterizzate da un aumento proporzionale (diminuzione) del numero totale di leucociti di tutti i tipi (ad esempio leucocitosi con ispessimento del sangue); nella maggior parte dei casi vi è un aumento (diminuzione) del numero di qualsiasi tipo di cellula, pertanto vengono utilizzati i termini "neutrofilia", "neutropenia", "linfocitosi", "linfopenia", "eosinofilia", "eosinopenia", "monocitosi", "monocitopenia" "Basofilia".
Nella valutazione clinica dei cambiamenti nel numero di leucociti, grande importanza è legata al rapporto percentuale delle singole forme di leucociti, cioè la formula dei leucociti.
Emocromo leucocitario di una persona sana:
Importo relativo Importo assoluto
Basofili............................0-1% 0-0.0650 x 10 9 / l
Eosinofili........................ 0,5-5% 0,02-0,30 x 10 9 / l
Neutrofili: - mielociti............ 0% assente
- pugnalato... 1-6% 0.040-0.300 x 10 9 / l
- segmentato....47-72% 2.0-5.5 x 10 9 / l
Linfociti..................................19-37% 1.2-3.0 x 10 9 / L
Monociti...............................3-11% 0,09-0,6 x 10 9 / L
Il conteggio dei leucociti viene eseguito su strisci di sangue periferico macchiato. Per la corretta interpretazione dei risultati dello studio della formula dei leucociti, si raccomanda di contare in quantità assolute, ma non in quelle relative. I metodi più comuni di pittura sbavature di Romanovsky-Giemsa, Pappenheim. Sotto immersione, vengono contate almeno 200 celle, quindi viene calcolato il rapporto percentuale di alcuni tipi di leucociti. L'analisi del leucogramma tenendo conto di altri parametri del sangue e del quadro clinico è un metodo valido di esame, aiuta nella diagnosi e nella determinazione della prognosi della malattia.
Le principali cause della neutrofilia.
Infezioni batteriche acute - localizzate e generalizzate.
Infiammazione o necrosi del tessuto.
Effetti medicinali (corticosteroidi).
Le principali cause di neutropenia.
Infezioni - batteriche (febbre tifoide, brucellosi, tularemia, febbre paratifo) e virali (epatite infettiva, morbillo, influenza, rosolia e altri).
Effetti micelotossici e soppressione della granulocitopoiesi (radiazioni ionizzanti, agenti chimici - benzene, anilina, DDT, effetti medicinali - citostatici e immunosoppressori; vitamina B12-anemia da carenza di acido folico, leucemia aleucemica acuta, anemia aplastica).
Esposizione anticorpale (forme immunitarie) - ipersensibilità a farmaci, malattie autoimmuni (LES, artrite reumatoide, leucemia linfatica cronica), manifestazioni isoimmunitarie (malattia emolitica del neonato).
Ridistribuzione e deposizione negli organi: condizioni di shock, malattie con splenomegalia e ipersplenismo.
Forme ereditarie (neutropenia cronica benigna familiare).
Le principali cause di eosinofilia.
Invasioni parassitarie (trichinosi).
Lesioni cutanee croniche - psoriasi, pemfigo, eczema.
Tumori (varianti eosinofiliche della leucemia).
Altre malattie - endocardite fibroplastica Lefflera, scarlattina.
Nella fase di recupero di infezioni e malattie infiammatorie (segno prognostico favorevole).
Cause di eosinopenia (aneosinofilia).
Aumento dell'attività di adrenocorticosteroidi nel corpo.
Le principali cause della basofilia:
Leucemia mieloide cronica ed eritmia.
Le principali cause della monocitosi.
Infezioni batteriche subacute e croniche.
Infezioni parassitarie - leishmaniosi, malaria.
Hemoblastosis - leucemia monocitica, linfogranulematoz, linfomi.
Altre condizioni sono SLE, sarcoidosi, artrite reumatoide, monocitosi infettiva; nel periodo di recupero dalle infezioni, quando si lascia agranulocitosi, dopo splenectomia.
La diminuzione del numero di monociti è importante soprattutto nella valutazione del rapporto linfocitario-monocitico nella tubercolosi polmonare.
Le principali cause di linfocitosi.
Infezioni: virali acute (mononucleosi infettiva, morbillo, rosolia, varicella), batteri cronici (tubercolosi, sifilide, brucellosi), protozoi (toxoplasmosi).
Emoblastosi (leucemia linfocitica, linfoma).
Altre malattie - ipertiroidismo, morbo di Addison, vitamina B12-anemia da carenza folica, anemia ipo-aplastica.
Linfocitopenia è osservata in LES, malattia di Hodgkin, tubercolosi diffusa dei linfonodi, nella fase terminale di insufficienza renale, malattia da radiazioni acute, stati di immunodeficienza, assunzione di glucocorticoidi.
L'aumento o la diminuzione del numero di certi tipi di leucociti nel sangue può essere relativo o assoluto. Se cambia solo la percentuale di un particolare tipo di globuli bianchi, si verificano neutrofilia relativa, eosinopenia relativa, ecc. L'aumento o la diminuzione del contenuto assoluto di qualsiasi tipo di leucociti, ovvero il numero di queste cellule per unità di volume di sangue, è definito neutrofilia assoluta, eosinopenia assoluta, ecc.
Spostare la formula a sinistra (aumentando il numero di forme giovani di neutrofili) è un segno di infiammazione o di un processo necrotico nel corpo.
Lo spostamento della formula dei leucociti a destra è caratteristico della malattia da radiazioni e della vitamina B12-anemia da carenza di acido folico.
L'assenza o la significativa riduzione del numero di tutti i tipi di leucociti granulari - i granulociti (neutrofili, eosinofili, basofili) sono indicati con il termine agranulocitosi. A seconda del meccanismo di occorrenza, si distinguono mielotossici (effetti delle radiazioni ionizzanti, assunzione citostatica) e immuni (agarucocitosi di aptene e autoimmune).
Conta dei leucociti
Il metodo di conteggio nella fotocamera. Assunzione e diluizione del sangue prodotto con il metodo del tubo. Nella provetta vengono introdotti 0,4 ml del fluido diluente e 0,02 ml di sangue capillare (preferibilmente Vidalevskaya). La diluizione risultante è praticamente considerata 1:20: una soluzione al 3-5% di acido acetico colorato con blu di metilene viene solitamente utilizzata come diluente (eritrociti a base di acido acetico, macchie di blu di metilene nei nuclei dei leucociti). Prima di riempire la camera la provetta di Goryaeva con sangue diluito viene completamente scossa. La camera viene riempita allo stesso modo del conteggio dei globuli rossi.
I leucociti sono molto più piccoli degli eritrociti (1-2 per quadrato grande), quindi, per la precisione, i conteggi vengono fatti in 100 quadrati grandi (non graduati). Calcolo: 100 grandi quadrati (1600 piccoli) sono contati un leucocita.
Ricordando che il volume di un quadratino è 1/4000 mm3 e il sangue viene diluito 20 volte, viene calcolato il numero di leucociti in 1 ml di sangue: 4000 20 e diviso per 1600 = a x 1/2. In pratica, per ottenere il contenuto effettivo dei leucociti in 1 ml di sangue, è sufficiente dividere la metà del numero ottenuto nel calcolo e aggiungere 2 zeri. L'errore medio del metodo è ± 7%.
Più preciso (errore del 2-3%) e perfetto è il conteggio dei leucociti che utilizzano dispositivi elettronici. Il conteggio dei leucociti nei contatori di particelle viene effettuato secondo lo stesso principio degli eritrociti. Il pre-sangue viene diluito e miscelato con qualsiasi globulo rosso di lisi dei reagenti. Nell'analizzatore automatico "Technicon", una soluzione di acido acetico viene utilizzata come tale nei dispositivi "Culter" e "Celloskop" - saponina o sapoglobina, che vengono aggiunti diluiti (1: 500, 1: 700) in soluzione di cloruro di sodio isotonico (6 gocce per 20 ml diluizione).
Il conteggio dei leucociti nel sangue viene eseguito su strisci di sangue periferico macchiato.
È meglio contare nel punto più sottile vicino alla fine dello striscio, almeno 200 cellule (eccetto la leucopenia pronunciata), e quindi ricavare il rapporto percentuale di alcuni tipi di globuli bianchi. Il conteggio è raccomandato nello stesso ordine: la metà delle celle deve essere contata nella parte superiore, metà nella parte inferiore del tratto, senza andare al bordo e al centro, zigzagando (3-4 campi di vista lungo il tratto, 3-4 campi ad angolo retto rispetto al centro del tratto, poi 3-4 campi sul lato parallelo al bordo, sempre ad angolo retto verso l'alto e così via su un lato).
Preparazione di strisci Il vetro accuratamente lavato e sgrassato (il suo bordo) tocca una goccia di sangue nel sito di iniezione. Lo smear crea un vetro per molatura, posizionandolo con un angolo di 45 ° rispetto al vetrino davanti alla goccia. Avendo portato il bicchiere a questa goccia, aspettano che il sangue si sparga lungo il bordo, poi con un movimento rapido e facile portano in avanti il vetro della levigatura, senza toglierlo dal soggetto prima che asciughi tutta la goccia.
Uno striscio fatto correttamente ha un colore giallastro (sottile), non raggiunge i bordi del vetro e finisce in una traccia (baffi).
Macchia di strisci asciutti prodotti dopo la fissazione preliminare. La migliore fissazione si ottiene in alcool metilico assoluto (3-5 minuti) o in una miscela di Nikiforov di parti uguali di etanolo assoluto ed etere (30 minuti).
Le principali pitture ematologiche comprendono il blu di metilene e il suo derivato - azzurro I (metilene azzurro) e azzurro II (una miscela di parti uguali di blu I e blu di metilene), eosina gialla solubile in acqua e solubile in acqua.
● Dipinto di Romanovsky-Giemsa. La pittura Romanovsky-Giemsa (fabbricata in fabbrica) ha la seguente composizione: Azur II - 3 g, eosina gialla solubile in acqua - 0,8 g, alcool metilico - 250 ml e glicerina - 250 ml. La soluzione di pittura funzionante viene preparata alla velocità di 1,5-2 gocce della vernice finita per 1 ml di acqua distillata. La vernice viene versata su una macchia con uno strato possibilmente più alto; tempo di colorazione - 30-35 minuti Dopo questo periodo, i tamponi vengono lavati con acqua e asciugati all'aria. In questo metodo, è possibile differenziare bene il nucleo, ma la granularità neutrofila del citoplasma è molto peggiore, quindi è ampiamente usata per colorare uno striscio di sangue periferico.
● Colorazione combinata May-Grunwald-Romanovsky-Giemsa secondo Pappenheim. Un colorante finito, un fissativo May-Grunwald, che è una soluzione di blu eosalmetilene in alcool metilenico, viene pipettato su uno striscio fisso per 3 minuti. Dopo 3 minuti, una quantità uguale di acqua distillata viene aggiunta alla vernice che ricopre la soluzione e la colorazione viene continuata per un altro 1 minuto. Successivamente, la vernice viene lavata via e la macchia viene asciugata all'aria. Quindi lo striscio essiccato viene ridipinto con una soluzione acquosa preparata di fresco di vernice Romanovsky per 8-15 minuti. Questo metodo è considerato il migliore, soprattutto per le macchie di puntini di midollo.
Un aumento del numero di leucociti nel sangue periferico al di sopra del livello normale è chiamato leucocitosi e una diminuzione è chiamata leucopenia. Leucocitosi (leucopenia) è raramente caratterizzata da un aumento proporzionale (diminuzione) del numero di leucociti di tutti i tipi, ad esempio leucocitosi con ispessimento del sangue. Nella maggior parte dei casi vi è un aumento del numero (diminuzione) di qualsiasi tipo di cella. L'aumento o la diminuzione del numero di singoli tipi di leucociti nel sangue può essere relativo o assoluto, in base al conteggio totale dei leucociti: normale, elevato o diminuito. La variazione del numero, il rapporto tra le forme individuali e la morfologia dei leucociti dipende dal tipo e dalla virulenza del patogeno, dalla natura, dal corso e dall'entità del processo patologico, dalla reazione individuale dell'organismo.
Leucociti (leucociti)
Leucociti. Determinazione quantitativa dei leucociti. Contando i leucociti usando la fotocamera Goryaeva. Contenuto quantitativo di leucociti. Leucocitosi.
Globuli bianchi
Il numero di leucociti nel sangue dipende sia dalla velocità della loro formazione, sia dalla loro mobilizzazione dal midollo osseo, nonché dal loro utilizzo e migrazione nei tessuti (alle lesioni), dalla cattura da parte dei polmoni e della milza. Questi processi, a loro volta, sono influenzati da un numero di fattori fisiologici, e quindi il numero di leucociti nel sangue di una persona sana è soggetto a fluttuazioni: sale alla fine della giornata, durante lo sforzo fisico, lo stress emotivo, l'assunzione di cibi proteici e bruschi cambiamenti nella temperatura ambiente.
Determinazione quantitativa dei leucociti
I leucociti vengono contati usando la fotocamera Goryaev e usando contatori automatici.
Contando i leucociti usando la fotocamera Goryaeva
Con il metodo in vitro di prendere il sangue per contare i leucociti:
- Nel tubo vengono versati 0,4 ml di una soluzione di acido acetico al 3-5% colorato con blu di metilene. Utilizzare una pipetta capillare per prelevare 20 μl di sangue da una goccia fresca (diluizione 20 volte), con cautela farla saltare in una provetta con un reagente e sciacquare la pipetta. Mescolare bene;
- un vetro di copertura pulito e asciutto viene strofinato sulla camera in modo che si formino anelli di arcobaleno nel punto di contatto;
- sangue diluito in una provetta, mescolare bene. L'estremità di un'asta di vetro rotonda prende una goccia di sangue e la porta sul bordo del vetro lucido della camera;
- dopo aver riempito la camera, rimane a riposo per 1 minuto per la sedimentazione dei leucociti;
- I leucociti sono considerati a basso ingrandimento (obiettivo × 8 o × 9, oculare × 10 o × 15) con un campo visivo oscurato (con un condensatore abbassato o un diaframma ristretto);
- per risultati soddisfacenti, i leucociti vengono contati in 100 quadrati grandi.
Conoscendo il volume di un quadrato grande e il grado di diluizione del sangue, trova il numero di leucociti in 1 μl e 1 l di sangue. Il lato del quadrato grande è di 1/5 mm, l'area è di 1/25 mm2, il volume dello spazio sopra questo quadrato è di 1/250 mm3.
Formula per il conteggio dei globuli bianchi:
dove B è il numero di leucociti in 100 quadrati grandi;
P - il grado di diluizione (20).
Conta dei leucociti
Norma: 4.0-9.0 × 10 9 / L
Viene chiamato l'aumento del numero di leucociti superiori a 9,0 × 10 9 / l
leucocitosi, una diminuzione del loro numero inferiore a 4,0 × 10 9 / l - leucopenia. Tuttavia, anche 3,5 × 10 9 in 1 l di leucociti per un numero di individui può essere la norma. Secondo la letteratura, queste persone hanno aumentato la resistenza immunitaria e hanno meno probabilità di ammalarsi, il che sembra essere dovuto alla necessità di una risposta immunitaria di avere una riserva di leucociti nei tessuti, dove ci sono 50-60 volte di più che nel sangue. Ovviamente, in individui sani con conta dei globuli bianchi a basso contenuto di sangue periferico, le loro riserve nei tessuti sono corrispondentemente aumentate. Questo fenomeno è spiegato dal carattere ereditario e familiare o da un aumento dell'influenza del sistema nervoso parasimpatico.
Leucopenia può essere funzionale e organica.
Leucopenia funzionale è associata a disregolazione della formazione del sangue e si osserva:
- con alcune infezioni batteriche e virali (febbre tifoide, influenza, vaiolo, rosolia, morbo di Botkin, morbillo);
- sotto l'azione di farmaci (sulfamidici, analgesici, anticonvulsivanti, antitiroidei, citostatici e altri farmaci);
- durante il lavoro muscolare, l'introduzione di proteine estranee, effetti del nervo e della temperatura, fame, stati ipotonici;
- la leucocitopenia falsa può essere associata all'aggregazione dei leucociti durante la conservazione a lungo termine del sangue a temperatura ambiente (oltre 4 ore).
Leucopenia organica derivante dall'aplasia midollare e dalla sua sostituzione con tessuto adiposo, si verifica quando:
- anemia aplastica;
- agranulocitosi;
- leucemia leucopenica;
- alcune forme di malattia di Hodgkin;
- radiazioni ionizzanti;
- ipersplenismo (primario e secondario);
- malattie del collagene.
leucocitosi
Leucocitosi è la reazione del sistema ematopoietico agli effetti
fattori esogeni ed endogeni. Ci sono leucocitosi fisiologiche e patologiche.
Leucocitosi fisiologica è:
- digestivo - dopo aver mangiato, particolarmente ricco di proteine; il numero di leucociti non supera 10,0-12,0 × 10 9 / le dopo 3-4 ore ritorna normale;
- con stress emotivo (adrenalina), grave sforzo fisico, raffreddamento, eccessiva esposizione solare (scottature solari), somministrazione di numerosi ormoni (catecolamine, glucocorticosteroidi, ecc.), nella seconda metà della gravidanza, durante le mestruazioni e a causa della distribuzione irregolare dei leucociti nel sangue il mainstream.
Leucocitosi patologica è divisa in assoluto e relativo.
Leucocitosi assoluta - un aumento del numero di leucociti nel sangue fino a diverse centinaia di migliaia (100.0-600.0 × 10 9 / le più).
- Il più spesso osservato con leucemia: in leucemia cronica - nel 98-100% dei casi, con leucemia acuta - nel 50-60%. Cambiare il rapporto tra le cellule dei leucociti nel midollo osseo e il punteggiato del sangue funge da base per la diagnosi di leucemia.
Leucocitosi relativa è osservata:
- processi infiammatori e infettivi acuti, con l'eccezione della febbre tifoide, dell'influenza, del vaiolo, della rosolia, della malattia di Botkin, del morbillo. La leucocitosi maggiore (fino a 70,0-80,0 × 10 9 / l) è osservata nella sepsi;
- sotto l'influenza di sostanze tossiche (veleni d'insetto, endotossine), radiazioni ionizzanti (immediatamente dopo l'irradiazione);
- come risultato dell'azione di corticosteroidi, adrenalina, istamina, acetilcolina e preparazioni digitalizzate;
- con disintegrazione tissutale (necrosi), infarto miocardico, trombosi delle arterie periferiche con sviluppo di cancrena, ustioni, pleurite essudativa, pericardite, uremia, coma epatico;
- significativa perdita di sangue nelle lesioni, interna, ginecologica e altre emorragie.
L'aumento del numero di leucociti nelle malattie infettive nella maggior parte dei casi è accompagnato da uno spostamento della formula dei leucociti a sinistra
Conta il numero di leucociti e piastrine
Fattori che influenzano la correttezza dello studio dei globuli bianchi
- lunga conservazione del sangue a temperatura ambiente
Norme del contenuto di leucociti nel sangue
Età Numero di leucociti
- 1 giorno 11,6 - 22,0
- 1 settimana 8.1.- 14.3
- 1 mese 7,6 - 12,4
- Adulti 4.0 - 9.0
Metodi per determinare il numero di leucociti nel sangue.
- Conteggio del numero di leucociti nella camera di conteggio
- Conteggio dei leucociti in analizzatori ematologici
Determinazione del numero di leucociti nella camera di conteggio.
- Il conteggio dei leucociti al microscopio viene effettuato dopo la lisi dei globuli rossi in 100 quadrati grandi della griglia di conteggio e ricalcolati per 1 litro di sangue, in base al volume dei quadrati e alla diluizione del sangue. Il conteggio dei leucociti deve essere effettuato entro 2-4 ore dalla raccolta del sangue.
- Se ci sono globuli rossi nucleati nel sangue periferico, essi non vengono lisati e contati insieme ai leucociti. In questo caso, per determinare il vero numero di leucociti, il numero di celle nella riga rossa viene sottratto dal numero totale di celle contate.
- Ad esempio: il numero totale di leucociti nel calcolo nella camera (o nell'analizzatore) -45x109 / l. Nel calcolare la formula dei leucociti, è stato rilevato che sono presenti 50 eritroblasti (normoblasti) per 100 leucociti.
Calcoliamo il vero numero di leucociti nel sangue:
150 celle - 45 x 109 / l
100 cellule (leucociti) - X
X = 100 * 45 * 10 / l / 150 = 30 * 10 / l
Quindi, il vero numero di leucociti nel sangue è 30 x109 / l.
Le principali fonti di errori nel calcolo dei leucociti nella camera:
- Rapporto errato di volume di acido acetico e del sangue prelevato in una provetta.
- Soluzione di acido acetico preparata in modo errato (a una concentrazione superiore al 5%, alcuni leucociti possono lisare, il che porterà a una sottostima del risultato).
- Esposizione prolungata del campione a temperature superiori a 28 ° C, che può accelerare la lisi dei leucociti nel campione e portare a una sottostima del risultato.
- Riempimento errato della camera di Goryaev. Come per il calcolo dei globuli rossi, la camera deve essere lasciata per 1 minuto per sistemare le cellule.
- La fotocamera Goryaev non è stata lavata abbastanza bene dopo la definizione precedente. I leucociti rimasti nella camera possono sovrastimare i risultati dell'analisi.
Metodi di conteggio delle piastrine
- nella camera di conteggio
Ogni gruppo di metodi presenta vantaggi e svantaggi.
- Il conteggio delle piastrine nella camera è sufficientemente preciso, non è necessario calcolare il numero di globuli rossi. D'altra parte, questo metodo è più laborioso, poiché le piastrine nella forma nativa sono rappresentate da elementi piccoli e scarsamente contrastati. Lo svantaggio del metodo è il conteggio delle piastrine nelle prossime ore dopo l'assunzione di sangue.
- Determinare il numero di piastrine negli strisci di sangue è significativamente inferiore nella sua accuratezza al metodo della camera o ai contatori automatici. Gli errori nel conteggio degli strisci di sangue possono essere dovuti alla scarsa qualità dello striscio e alla distribuzione irregolare associata delle piastrine, determinazione inaccurata del numero di globuli rossi. Uno svantaggio significativo del metodo è la necessità di contare simultaneamente piastrine e globuli rossi nel sangue. Il vantaggio è la capacità di studiare le piastrine in qualsiasi momento, indipendentemente dal momento del prelievo di sangue.
- Il metodo per determinare le piastrine utilizzando un analizzatore ematologico consente di determinare con precisione il numero di piastrine, il loro volume medio e la distribuzione per volume.
Conta dei leucociti
Il numero di leucociti viene calcolato usando un contatore automatico o in una camera di Goryaev. Per contare i leucociti nella camera, viene preparato un liquido turco - una soluzione di acido acetico colorata con una soluzione acquosa di blu di metilene (0,1 ml di una soluzione allo 0,1% di blu di metilene viene aggiunta a 9 ml di acido acetico al 10%). In una provetta versare 0,4 ml di liquido Türk. Assumere esattamente 0,02 ml di sangue, aggiungere con cautela al fluido di diluizione. La diluizione del sangue è 1:20. Mescolare bene e lasciare per 4 minuti. Riempi la camera Goryaeva, dopo aver agitato accuratamente la provetta con sangue diluito. La fotocamera viene lasciata per 1 minuto su una superficie piana per la sedimentazione dei leucociti. Quindi i leucociti vengono conteggiati a basso ingrandimento del microscopio (obiettivo 8, oculare 10 o 15) con un campo visivo oscurato (con il condensatore abbassato o il diaframma ristretto). I leucociti sono considerati in 100 quadrati grandi non dichiarati, che corrisponde a 1600 piccoli. I risultati del conteggio delle cellule in grandi quadrati riepilogano e calcolano il loro numero in 1 ml di sangue utilizzando la formula:
dove X è il numero di leucociti in 1 ml di sangue; A - il numero di cellule contate in 100 quadrati grandi, 1600 - il numero di quadratini; 20 - diluizione del sangue; 4000 è un moltiplicatore risultante in un volume di 1 ml di sangue, in base al volume di un quadratino (1/4000 μl).
Conteggio della formula dei leucociti: vengono esaminati gli strisci di sangue periferico macchiato. Una condizione necessaria per la corretta considerazione delle caratteristiche morfologiche delle cellule del sangue è uno striscio di sangue ben fatto e ben macchiato. Uno striscio di sangue viene preparato su vetrini asciutti, puliti e ben sgrassati, invecchiati in una miscela di Nikiforov (alcool etilico 96 º e etere dietilico 1: 1). Prendendo un vetrino per i bordi lunghi, tocca la sua superficie con una goccia di sangue (ma non con la pelle) rilasciata dalla puntura, o applica una goccia di sangue con una micropipetta o un capillare. Un vetrino viene tenuto sul tavolo o nella mano sinistra per i bordi stretti. Con la mano destra, applicare il vetro smerigliato con un bordo stretto al vetro con il sangue a sinistra della goccia con un angolo di 45 ° e spingerlo a destra fino a toccare il sangue. Aspettano che il sangue si sparga sull'intero bordo del vetro smerigliato, e quindi, con un movimento rapido e veloce, lo conduca da destra a sinistra fino a quando l'intera goccia non è esaurita. Una goccia di sangue deve essere piccola e proporzionata in modo che l'intera macchia sia posizionata sul vetro, non raggiungendo 1-1,5 cm prima del bordo. Una macchia ben fatta è sottile, ha un colore giallastro e finisce in una "scopa". Strisci di sangue essiccati all'aria vengono posti in appositi piatti per il fissaggio o in normali bicchieri di vetro riempiti con liquido di fissaggio (metilico, tempo di fissazione 3-5 minuti, alcool etilico, 30 minuti, miscela di Nikiforov, 20-30 minuti). I preparati fissi vengono asciugati nell'aria e poi colorati con la tintura Romanovsky-Giemsa. La soluzione di pittura finita Romanovsky-Giemsa (azureosina) è diluita 1:10 nel volume richiesto per la colorazione. Gli strisci fissi vengono versati con vernice diluita, che viene versata sullo striscio con uno strato possibilmente più alto. La colorazione dura a seconda della temperatura dell'aria nella stanza da 25 a 45 minuti. Dopo la verniciatura, lavare la vernice con acqua distillata e asciugare i pennini verticalmente in un supporto di legno. La microscopia degli strisci di sangue viene eseguita con immersione a 100 × 10 ingrandimenti. Il conteggio dei leucociti viene eseguito lungo una linea a zigzag ("linea Meander"). Vengono contate 100-200 cellule, tenendo conto del numero di singole forme di leucociti: neutrofili segmentati e segmentati, eosinofili, basofili, monociti, linfociti. Calcola la percentuale di ciascun tipo di cella.
Conteggio del numero assoluto di fagociti e linfociti Il numero assoluto di fagociti (neutrofili e monociti) e linfociti di vertebrati superiori è calcolato sulla base dei dati sul numero di leucociti nella formula del sangue periferico e dei leucociti.
Test di funzionalità fagocitica
Determinazione dell'indice fagocitico e del numero fagocitico
Un gran numero di tecniche sono state sviluppate per valutare l'attività di assorbimento e digestione dei leucociti. Tutti sono basati sulla capacità dei fagociti di assorbire le particelle estranee che costituiscono il sistema di test (un tipo specifico di microrganismi, zymosan, lattice - l'oggetto di assorbimento). La rivelazione viene eseguita in vitro o in vivo. Il corso generale di determinazione è il seguente: sangue fresco e citrato (o sospensione dei fagociti) è mescolato con un uguale volume di sospensione microbica giornaliera sospesa (Saccharomyces cerevisiae, Staphilococcus aureus, S. albus, E.coli, A. nydrophila) o un altro oggetto di assorbimento. La miscela viene miscelata delicatamente e posta in un termostato (37-40 ° C - per sangue caldo a seconda della temperatura normale del corpo, 26 ° C - per pesci amanti del calore e inferiore per amanti del freddo). Dopo 15, 30, 45, 60 e 90 minuti, gli strisci vengono preparati su vetrini, essiccati, fissati con alcool metilico o una miscela di Nikiforov e colorati secondo Romanovsky-Giemsa. Esaminano le macchie sotto immersione e determinano l'attività fagocitaria - la percentuale di fagociti che partecipano alla fagocitosi, l'indice fagocitico - il numero di microbi testati catturati da un leucocita fagocitico, il numero fagocitico - il numero medio di oggetti fagocitici per 1 neutrofilo attivo. La valutazione degli indicatori a differenti intervalli di tempo ci consente di stimare la dinamica della fagocitosi. Normalmente, dopo 90 minuti, l'indice fagocitico deve essere inferiore a 45 minuti e 60 minuti, a causa della digestione dei microbi. In caso di violazione della digestione, non cambia.
Valutazione dell'attività funzionale dei fagociti mediante la reazione di riduzione del tetrazolo nitro-blu (test NBT)
Questo test è un indicatore della funzione battericida dei fagociti e consente di valutare la loro capacità di uccidere l'ossigeno. Quando viene attivato questo meccanismo di uccisione, viene attivato l'enzima NADPH ossidasi, che porta alla comparsa di specie reattive dell'ossigeno nel fagocita. Il rilascio di tali sostanze nella cellula è chiamato un'esplosione di ossigeno (respiratoria), che può essere registrata usando il test NBT. Nella formulazione di questo test, la sostanza nitrosinio tetrazolio viene aggiunta ai fagociti, viene assorbita dalla cellula e, in presenza di specie reattive dell'ossigeno, si trasforma in una sostanza di colore blu scuro, diformazan. Più granuli blu scuro sono fissati sulla superficie o all'interno del fagocita, più forme di ossigeno attivo si formano, più si uccide l'ossigeno.
Il test NBT è impostato in due versioni: spontanea e indotta. Quando si imposta un test NBT spontaneo, i fagociti vengono coltivati in presenza di NST senza attivazione preliminare delle cellule, quando si esegue il test NBT indotto, un attivatore della reazione fagocitica viene aggiunto al terreno di coltura. L'impostazione del test NBT in due varianti consente di calcolare la riserva funzionale delle cellule, che è la differenza tra il numero (intensità) delle cellule indotte diformazan-positive e il numero (intensità) delle cellule spontanee diformazan-positive. I valori del test NBT indotto caratterizzano l'attività delle cellule fagocitiche in presenza di uno stimolo antigenico e sono considerati come un criterio della loro disponibilità per la fagocitosi completa. Il test NBT spontaneo consente di stimare il grado di attivazione dei meccanismi di uccisione dipendenti dall'ossigeno dei fagociti non attivati. Caratterizza il grado di attivazione dei sistemi microbicidi intracellulari.
Per formare un test NBT spontaneo, 0,05 ml di soluzione allo 0,2% di NBT in tampone fosfato di potassio (0,1, pH 7,3) e 0,05 ml dello stesso tampone vengono aggiunti a 0,1 ml di sangue. In parallelo, viene posto un campione per tenere conto del test NBT indotto, in cui, invece di 0,05 ml di tampone, viene aggiunto lo stesso volume di attivatore fagocitico (ad esempio pirogenico alla concentrazione di 50 μg / ml). La miscela di reazione viene termostatata a bagnomaria a 37 ° C (30-60 min). Gli strisci a media densità vengono preparati, essiccati all'aria e fissati in alcool etilico o miscela di Nikiforov (20 min), quindi verniciati con una soluzione acquosa di rosso neutro (0,1%, 1 min)
Dopo la reazione, gli strisci di sangue vengono microscopati sotto l'immersione (obiettivo 100 ×, oculare 10 ×). Tra 100 cellule, viene contata la percentuale di neutrofili attivati (DAN,%) contenenti granuli diformazan. In base alla quantità di dipherformazan depositato nelle cellule, la loro attività viene valutata in unità arbitrarie e viene calcolato l'indice di attivazione dei neutrofili (IAN, unità utilizzate):
dov'è Hneg. - il numero di cellule che non contengono granuli diformazan;
H1 - il numero di celle in cui l'area dei depositi diformazan è inferiore a 1/3 dell'area centrale;
H2 - il numero di cellule in cui i depositi diformazan vanno da 1/3 a tutte le dimensioni del nucleo;
H3 - il numero di cellule in cui i depositi diformazan occupano un'area più ampia del nucleo.
La derivazione del coefficiente di mobilizzazione (KM) eseguita secondo la seguente formula: